通过遗传改造提高水稻谷胱甘肽和猕猴桃维生素C含量的初探
发布时间：2021-06-23 23:11
谷胱甘肽（GSH）是一种有益于人体健康的抗氧化物质,在食品工业中有着广泛的应用,如作为保健品、食品添加剂等,还可以作为药物治疗某些疾病。而水稻是世界性的经济作物,是大部分地区的主食,提高稻米中的营养物质是食品领域中的重点。GSH是一种植物或动物的应激性代谢产物,正常状态下的植物体内的GSH水平是不高的,本文欲通过遗传改造提高水稻中的GSH含量。本文第二部分针对CATB、CATC各设计了2个靶点,通过酶切、连接将启动子、g RNA与接头靶点连在一起,再通过巢式PCR大量扩增正确的连接产物,又称g RNA表达盒,最后再经过酶切、连接等步骤将g RNA表达盒与PYLCRISPR/Cas9连接,构建了CRISPR/Cas9Pubi∷Os U∷CATC/CATB敲除载体。并且筛选出了6棵含Cas9的T0代阳性苗,阳性苗测序结果显示出植株出现了单个碱基缺失、插入、替换,和部分片缺失等多种突变,6棵T0代阳性苗的CAT酶活都显著下降。本文成功将CRISPR/Cas9多靶点敲除系统成功应用在水稻中,获得了打靶成功的阳性水稻植株,为提高水稻中GSH的含量的研究提供了基础材料。同GSH一样,抗坏血酸（AS...
【文章来源】：合肥工业大学安徽省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
GSH的化学结构式Figure1.1ChemicalstructureofGSH
胖匾?饔谩Ｈ缤?.5所示，ASC在氧化应激期间被氧化成不稳定的自由基单氢抗坏血酸（Monodehydroascorbate，MDHA），MDHA会分解成ASC和DHA，MDHA在单氢抗坏血酸还原酶（Monodehydroascorbatereductase，MDHAR）的作用下还原为ASC，在DHAR的作用下形成ASC[50]。因此抗坏血酸过氧化物酶（APX）、MDHAR、DHAR是ASC循环再生的直接酶促成分。一般提高植物体内的ASC的积累有三种常用的方式，生物合成酶的过表达，循环酶的过表达以及对抗坏血酸氧化酶的反义抑制，本文欲探究循环酶的功能，以期为提高ASC的水平的遗传改造奠定基矗图1.2ASC循环再生的机制图[50]Figure1.2ThemechanismdiagramofASCcycleregeneration
合肥工业大学硕士学位论文8图1.3ZFNs和TALEN两种基因编辑技术[62]Figure1.3Twogeneeditingtechnologies:ZFNsandTALEN1.5.3CRISPR/Cas9系统ZFNs的效率较低、费用昂贵且影响脱靶的因素较多。TALENs的靶向非常精确，设计比ZFNs简单，费用比ZFNs便宜少许，但总体来说仍然较贵，该技术脱靶率较低，效率为一般水平，ZFNs、TALENs都是由蛋白特异性识别并结合靶DNA序列，因此ZFN和TALEN的载体构建是一个复杂且耗时的过程，这种方式使得它们的应用较为局限。最近的CRISPR/Cas9技术是基因编辑技术发展的重大飞跃，CRISPR/Cas9由向导RNA（sgRNA）和Cas9蛋白两部分组成(图1.2c)，与TALENs和ZFNs相比，CRISPR/Cas9的设计和构建都较为简单，且成本低、对细胞毒性孝打靶效率高，动物、植物或微生物等都在该技术的适用范围内[62]。1.5.3.1CRISPR/Cas9技术的发展历程CRISPR于1987年被首次报道，那时还未命名为CRISPR，日本科学在大肠杆菌的碱性磷酸酶同工酶转化蛋白的3′端的侧翼发现了特殊的结构，即有5个高度同源的20bp核苷酸分别被32bp序列隔开[63]，但是该科学家并未对此特殊结构深入研究。Mojica等于1993年在研究嗜盐古细菌在不同盐含量对PstI剪切的机制的影响时也发现了类似的回文对称的序列的结构[64]。1995年，Mojica在多种嗜盐古细菌都发现了串联重复序列[65]，并对这种序列进行了报道，但还不能完全解释这种结构的确切的生物学作用。随着科学家们的关注与深入研究，Jansen等于2002年将这种重复序列命名为“簇状规则间隔的短回文重复序列（Theclusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR）”[66]，并总结了CRISPR的特点，CRISPR的重复序列被大小相似的非重复DNA隔开且这种直接重复序列的大小不等，从鼠伤寒沙门氏菌中的21b
本文编号：3245844
【文章来源】：合肥工业大学安徽省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
GSH的化学结构式Figure1.1ChemicalstructureofGSH
胖匾?饔谩Ｈ缤?.5所示，ASC在氧化应激期间被氧化成不稳定的自由基单氢抗坏血酸（Monodehydroascorbate，MDHA），MDHA会分解成ASC和DHA，MDHA在单氢抗坏血酸还原酶（Monodehydroascorbatereductase，MDHAR）的作用下还原为ASC，在DHAR的作用下形成ASC[50]。因此抗坏血酸过氧化物酶（APX）、MDHAR、DHAR是ASC循环再生的直接酶促成分。一般提高植物体内的ASC的积累有三种常用的方式，生物合成酶的过表达，循环酶的过表达以及对抗坏血酸氧化酶的反义抑制，本文欲探究循环酶的功能，以期为提高ASC的水平的遗传改造奠定基矗图1.2ASC循环再生的机制图[50]Figure1.2ThemechanismdiagramofASCcycleregeneration
合肥工业大学硕士学位论文8图1.3ZFNs和TALEN两种基因编辑技术[62]Figure1.3Twogeneeditingtechnologies:ZFNsandTALEN1.5.3CRISPR/Cas9系统ZFNs的效率较低、费用昂贵且影响脱靶的因素较多。TALENs的靶向非常精确，设计比ZFNs简单，费用比ZFNs便宜少许，但总体来说仍然较贵，该技术脱靶率较低，效率为一般水平，ZFNs、TALENs都是由蛋白特异性识别并结合靶DNA序列，因此ZFN和TALEN的载体构建是一个复杂且耗时的过程，这种方式使得它们的应用较为局限。最近的CRISPR/Cas9技术是基因编辑技术发展的重大飞跃，CRISPR/Cas9由向导RNA（sgRNA）和Cas9蛋白两部分组成(图1.2c)，与TALENs和ZFNs相比，CRISPR/Cas9的设计和构建都较为简单，且成本低、对细胞毒性孝打靶效率高，动物、植物或微生物等都在该技术的适用范围内[62]。1.5.3.1CRISPR/Cas9技术的发展历程CRISPR于1987年被首次报道，那时还未命名为CRISPR，日本科学在大肠杆菌的碱性磷酸酶同工酶转化蛋白的3′端的侧翼发现了特殊的结构，即有5个高度同源的20bp核苷酸分别被32bp序列隔开[63]，但是该科学家并未对此特殊结构深入研究。Mojica等于1993年在研究嗜盐古细菌在不同盐含量对PstI剪切的机制的影响时也发现了类似的回文对称的序列的结构[64]。1995年，Mojica在多种嗜盐古细菌都发现了串联重复序列[65]，并对这种序列进行了报道，但还不能完全解释这种结构的确切的生物学作用。随着科学家们的关注与深入研究，Jansen等于2002年将这种重复序列命名为“簇状规则间隔的短回文重复序列（Theclusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR）”[66]，并总结了CRISPR的特点，CRISPR的重复序列被大小相似的非重复DNA隔开且这种直接重复序列的大小不等，从鼠伤寒沙门氏菌中的21b
本文编号：3245844
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