农产品典型真菌毒素生物识别材料与快速检测方法研究
发布时间：2021-11-13 12:39
真菌毒素危害大、防控难,威胁农产品质量安全。开展农产品真菌毒素现场快速检测技术研究,及时发现污染,是防止真菌毒素进入食物链的重要手段。目前快检技术主要面临的挑战表现在:部分真菌毒素高亲和力抗体匮乏、多种类风险因子同步检测难、速测产品抗干扰性差。针对上述问题,本学位论文研制出高灵敏高特异性单克隆抗体、纳米抗体,改良了核酸模拟抗体（适配体）等生物识别材料;并基于三种识别材料依次建立了系列真菌毒素快速检测技术,用于粮油、乳品、水果等不同农产品中典型真菌毒素的高灵敏检测。论文最后,系统分析了这三类主要识别材料的应用特性及在快检产品开发中应用前景。具体研究结果如下:（1）研制出伏马毒素B1（FB1）、二乙酰镳草镰刀菌烯醇（DAS）等系列单克隆抗体（mAb）,建立了粮油中FB1灰度成像、真菌毒素与农残同步侧向流层析,及基于新型纳米仿生催化材料的DAS免疫气压传感检测方法。（1）研制出FB1单克隆抗体7A11,半抑制浓度（IC50）为0.66 ng/mL。建立了两类结果输出方式的现场快速检测方法:基于纳米金比色定性方法与灰度成像定量方...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：168 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
常见真菌毒素的化学结构式Fig.1-1ChemicalstructureofmycotoxinFumonisinB1
缺挥糜诿庖呱?锎?醒芯俊?单域重链抗体也被称为纳米抗体，其来源于骆驼科或者软骨鱼类体内的重链抗体可变区部分。纳米抗体是目前发现具有抗原识别能力的最小抗体，分子量仅为15-17kDa，远小于单克隆抗体的150kDa。纳米抗体通过扩增重链抗体自然存在的两种免疫球蛋白亚型IgG2和IgG3的可变区（VHH）基因片段，重组入噬菌粒中并转化至抑制型E.coli感受态细胞，通过辅助噬菌体作用后重新组装、分泌到体外，形成噬菌体展示纳米抗体库。经过数轮“吸附-洗脱-富集”的生物筛选方法筛选出能够特异结合靶标分子的噬菌体展示纳米抗体（图1-2）。纳米抗体的抗原结合位点的突起结构能识别靶标物凹陷、裂隙表位，提高了对靶标物的结合能力和多样性；纳米抗体具有的柔性结构可在高温后折叠恢复结构，具有更好的热稳定性，能够耐受70℃高温，在37℃或者4℃条件下储藏数月仍可保持活性，在-20℃条件下可保存更久(DUMOULINetal.,2009)。抗独特型纳米抗体（anti-idiotypeantibody,AIdnb）是利用单克隆抗体免疫羊驼获得针对抗体可变区的抗原特异表位群抗抗体，AId不仅具有特稳性，还可作为抗原的替代物。图1-2纳米抗体的筛选过程(ROTHBAUER,2018)Fig.1-2SchematicmethodtogeneratenanobodyWANG等通过噬菌体展示库筛选出了黄曲霉毒素抗独特性纳米抗体替代抗原，用于间接竞争ELISA方法检测(WANGetal.,2013a)。He等研制了黄曲霉毒素特异性纳米抗体，可耐有机溶剂及高温，其可应用于ELISA方法检测农产品中黄曲霉毒素含量，灵敏度达到0.754ng/mL(HEetal.,2014)。Tang等建立了基于玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素抗独特型纳米抗体的真菌毒素多组分免疫层析方法(TANGetal.,2017)。此外，纳米抗体还可以进行化学改性固定在传感器表面(SAERENSetal.,2005)，接枝于纳米颗粒(VANDEBROE
中国农业科学院博士学位论文第一章引言8图1-3核酸适配体SELEX筛选过程(KIMandGU,2013)Fig.1-3SELEXtechnologyaptamerscreeningprocess基于核酸适配体的生物传感器在1996年被首次提出，并且被应用于各种小分子尤其是真菌毒素的检测(WANGetal.,2019;YANGetal.,2017;ZHUetal.,2019)。2008年Cruz-aguado和Penner筛选出首个真菌毒素核酸适配体（可识别OTA的核酸适配体）。随后OTA核酸适配体的结构特性以及应用研究被更多学者所关注。2011年，Yang等发现在20mM二价钙离子溶液中，OTA的亲和力更高。通过圆二色谱方法发现，OTA可使核酸适配体由随机卷曲结构转变为紧密的刚性反平行G-四链体结构(YANGetal.,2012;YANGetal.,2011)。2010年，经过18轮SELEX筛选，最终研制出六个对FB1有亲和力的核酸适配体序列。其中FB1-39的解离常数为100±30nM(MCKEAGUEetal.,2010)，该项研究为核酸适配体传感器和基于核酸适配体的固相萃取柱的面市提供了可能。NeoventuresBiotechnologyInc.公司获得了AFB1和ZEN核酸适配体专利，亲和力为10nM，并研制出基于核酸适配体的侧向流层析传感器用于检测OTA，AFB1和ZEN。（3）分子印记聚合物分子印记聚合物（Molecularlyimprintedpolymer，MIP）是一种可应用于传感器、医疗设备等领域的识别组件，不仅可识别毒素等小分子物质，还可以识别蛋白质、病毒和微生物等(UZUNL,2016;WACKERLIG,2015)。在聚合物合成过程中，形成聚合物的官能团与模板分子相互作用，在聚合物形成后模板分子被移除，留下具有特定结合位点的聚合物材料（图1-4）。MIP具有许多不同的合成技术。常用的是非共价印记方法，具体可描述为印迹分子与功能单体之间以离子键、氢键、范德华力等非共价键相互作用，包括本体聚合、沉淀聚合、微乳液聚合、固相印记、核壳印迹
【参考文献】：
期刊论文
[1]A simple aptamer molecular beacon assay for rapid detection of aflatoxin B1[J]. Chao Wang,Linlin Sun,Qiang Zhao. Chinese Chemical Letters. 2019(05)
[2]毛细管电泳筛选盐酸克伦特罗核酸适配体的方法研究[J]. 杨歌,朱超,刘晓慧,王勇,屈锋. 分析化学. 2018(10)
博士论文
[1]黄曲霉毒素杂交瘤细胞株的选育及免疫层析检测技术研究[D]. 张道宏.中国农业科学院 2011
本文编号：3493035
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：168 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
常见真菌毒素的化学结构式Fig.1-1ChemicalstructureofmycotoxinFumonisinB1
缺挥糜诿庖呱?锎?醒芯俊?单域重链抗体也被称为纳米抗体，其来源于骆驼科或者软骨鱼类体内的重链抗体可变区部分。纳米抗体是目前发现具有抗原识别能力的最小抗体，分子量仅为15-17kDa，远小于单克隆抗体的150kDa。纳米抗体通过扩增重链抗体自然存在的两种免疫球蛋白亚型IgG2和IgG3的可变区（VHH）基因片段，重组入噬菌粒中并转化至抑制型E.coli感受态细胞，通过辅助噬菌体作用后重新组装、分泌到体外，形成噬菌体展示纳米抗体库。经过数轮“吸附-洗脱-富集”的生物筛选方法筛选出能够特异结合靶标分子的噬菌体展示纳米抗体（图1-2）。纳米抗体的抗原结合位点的突起结构能识别靶标物凹陷、裂隙表位，提高了对靶标物的结合能力和多样性；纳米抗体具有的柔性结构可在高温后折叠恢复结构，具有更好的热稳定性，能够耐受70℃高温，在37℃或者4℃条件下储藏数月仍可保持活性，在-20℃条件下可保存更久(DUMOULINetal.,2009)。抗独特型纳米抗体（anti-idiotypeantibody,AIdnb）是利用单克隆抗体免疫羊驼获得针对抗体可变区的抗原特异表位群抗抗体，AId不仅具有特稳性，还可作为抗原的替代物。图1-2纳米抗体的筛选过程(ROTHBAUER,2018)Fig.1-2SchematicmethodtogeneratenanobodyWANG等通过噬菌体展示库筛选出了黄曲霉毒素抗独特性纳米抗体替代抗原，用于间接竞争ELISA方法检测(WANGetal.,2013a)。He等研制了黄曲霉毒素特异性纳米抗体，可耐有机溶剂及高温，其可应用于ELISA方法检测农产品中黄曲霉毒素含量，灵敏度达到0.754ng/mL(HEetal.,2014)。Tang等建立了基于玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素抗独特型纳米抗体的真菌毒素多组分免疫层析方法(TANGetal.,2017)。此外，纳米抗体还可以进行化学改性固定在传感器表面(SAERENSetal.,2005)，接枝于纳米颗粒(VANDEBROE
中国农业科学院博士学位论文第一章引言8图1-3核酸适配体SELEX筛选过程(KIMandGU,2013)Fig.1-3SELEXtechnologyaptamerscreeningprocess基于核酸适配体的生物传感器在1996年被首次提出，并且被应用于各种小分子尤其是真菌毒素的检测(WANGetal.,2019;YANGetal.,2017;ZHUetal.,2019)。2008年Cruz-aguado和Penner筛选出首个真菌毒素核酸适配体（可识别OTA的核酸适配体）。随后OTA核酸适配体的结构特性以及应用研究被更多学者所关注。2011年，Yang等发现在20mM二价钙离子溶液中，OTA的亲和力更高。通过圆二色谱方法发现，OTA可使核酸适配体由随机卷曲结构转变为紧密的刚性反平行G-四链体结构(YANGetal.,2012;YANGetal.,2011)。2010年，经过18轮SELEX筛选，最终研制出六个对FB1有亲和力的核酸适配体序列。其中FB1-39的解离常数为100±30nM(MCKEAGUEetal.,2010)，该项研究为核酸适配体传感器和基于核酸适配体的固相萃取柱的面市提供了可能。NeoventuresBiotechnologyInc.公司获得了AFB1和ZEN核酸适配体专利，亲和力为10nM，并研制出基于核酸适配体的侧向流层析传感器用于检测OTA，AFB1和ZEN。（3）分子印记聚合物分子印记聚合物（Molecularlyimprintedpolymer，MIP）是一种可应用于传感器、医疗设备等领域的识别组件，不仅可识别毒素等小分子物质，还可以识别蛋白质、病毒和微生物等(UZUNL,2016;WACKERLIG,2015)。在聚合物合成过程中，形成聚合物的官能团与模板分子相互作用，在聚合物形成后模板分子被移除，留下具有特定结合位点的聚合物材料（图1-4）。MIP具有许多不同的合成技术。常用的是非共价印记方法，具体可描述为印迹分子与功能单体之间以离子键、氢键、范德华力等非共价键相互作用，包括本体聚合、沉淀聚合、微乳液聚合、固相印记、核壳印迹
【参考文献】：
期刊论文
[1]A simple aptamer molecular beacon assay for rapid detection of aflatoxin B1[J]. Chao Wang,Linlin Sun,Qiang Zhao. Chinese Chemical Letters. 2019(05)
[2]毛细管电泳筛选盐酸克伦特罗核酸适配体的方法研究[J]. 杨歌,朱超,刘晓慧,王勇,屈锋. 分析化学. 2018(10)
博士论文
[1]黄曲霉毒素杂交瘤细胞株的选育及免疫层析检测技术研究[D]. 张道宏.中国农业科学院 2011
本文编号：3493035
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