γ-[Glu] ( n（1-5）-Gln的酶法合成及其应用研究
发布时间：2022-01-12 19:10
γ-谷氨酰肽广泛分布于自然界中,参与生命体的多种生理活动。谷氨酰胺酶（EC3.5.1.2）是一种水解酶,同时具有转肽作用。本论文筛选出利于催化γ-谷氨酰转肽反应的谷氨酰胺酶,酶促合成一种未被报道的γ-谷氨酰肽(γ-[Glu]n（1-5）-Gln),进一步探究外部条件对其合成的影响及其钙离子螯合能力和抗冻性。实验结果如下:首先研究两种解淀粉芽孢杆菌源谷氨酰胺酶（E1和E2）的酶学特性。结果表明,E1和E2均能催化水解和转肽反应;在p H值10.0、37.0℃下,E1的水解活性优于E2,转肽活性二者无明显差别（P<0.05）;在p H值4.0-10.0、4.0-45.0℃,E1的耐受性优于E2;色氨酸、脯氨酸、精氨酸、苏氨酸和谷氨酰胺均可作为E1催化γ-谷氨酰转肽反应时的最佳γ-谷氨酰受体。因此,选用E1作为后续实验用酶。其次利用E1酶促合成γ-[Glu]n（1-5）-Gln,并探究底物浓度和初始p H值对其合成的影响。结果表明,E1具有催化合成γ-[Glu]n（1-5）-Gln的能力;UPLC-MS/MS鉴定出酶促反...
【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
pH值对两种谷氨酰胺酶水解和转肽酶活的影响
华南理工大学硕士学位论文20有关[129]。由图2-1还可以看出，在pH值为3.0时，E1没有水解酶活，转肽相对酶活仍有25.18%，E2基本失活；随着pH值增加，E1和E2的水解相对酶活先逐渐增加，分别在pH值为11.0和10.0时达到峰值，随后下降；在pH值为12.0时E1水解相对酶活降至54.40%，E2水解相对酶活降至47.46%；二者的转肽相对酶活起初也随着pH值增加逐渐增加，在最适pH值时达到峰值后下降，在pH值为12.0时E1转肽相对酶活降至70.88%，E2转肽相对酶活降至15.54%。这些结果表明E1比E2对强酸、强碱条件具有更强的耐受性。图2-2pH值对两种谷氨酰胺酶水解和转肽酶活稳定性的影响Figure2-2EffectofpHonthestabilityofhydrolaseactivityandtranspeptidaseactivityoftwoglutaminases由图2-2可以看出，在pH值4.0-10.0范围内，两种谷氨酰胺酶的水解和转肽相对酶活均比较稳定，在此pH值范围内保持24.0h后水解和转肽相对酶活均能保持80%以上。杨娟发现解淀粉芽孢杆菌源谷氨酰胺酶在pH值6.0-11.0范围内的溶液中保存24.0h后其转肽相对酶活均可保持在90%以上[48]。杨成等人发现硝基还原假单胞菌源谷氨酰胺酶在pH值5.0-11.0范围内水解酶活基本保持稳定[134]。这些报道与本研究有些差异，可能是菌种来源不同、培养条件以及产物的分离纯化工艺不同和测定方法不同导致的。从图2-2还可以看出，在pH值12.0环境下保持24.0h后，两种谷氨酰胺酶均已失活，而在pH值11.0环境下保持24.0h后，E1水解相对酶活为93.61%，转肽相对酶活为91.90%，E2水解相对酶活为63.16%，转肽相对酶活为68.76%，这些结果表明E1比E2对强碱条件具有更强的耐受性。
第二章两种谷氨酰胺酶的酶学特性研究212.3.3温度对谷氨酰胺酶水解和转肽酶活的影响由图2-3可以看出，两种谷氨酰胺酶催化水解和转肽反应的最适反应温度不同，E1催化水解和转肽反应的最适反应温度为45.0和37.0℃，E2催化水解和转肽反应的最适反应温度为37.0和45.0℃，这和卢慧茵等人报道的有所不同，可能和菌种的培养条件以及产物的分离纯化工艺有关[129]。由图2-3还可以看出，二者的水解和转肽相对酶活起初随着反应温度的上升逐渐增加，在最适反应温度达到峰值后降低。E1在75.0℃时水解和转肽相对酶活保持在13.00%和31.04%，E2对反应温度更敏感，在75.0℃时已基本失活。这是因为适当的温度提高有利于反应的正向进行，而当温度过高时，蛋白变性导致酶的分子结构遭到破坏而失去活力[129]。图2-3温度对两种谷氨酰胺酶水解和转肽酶活的影响Figure2-3Effectoftemperatureonthehydrolaseactivityandtranspeptidaseactivityoftwoglutaminases由图2-4可以看出，E1在4.0、25.0、37.0、45.0和55.0℃下水解酶活稳定，保存240.0min仍能保持80%以上相对酶活，在65.0和75.0℃下保存30.0min后基本无水解酶活，转肽酶活在45.0℃下随着保存时间延长而降低，在55.0、65.0和75.0℃下保存30.0min后基本无转肽酶活；E2在4.0、25.0和37.0℃水解和转肽酶活都很稳定，在45.0℃下随着保存时间延长水解和转肽酶活都下降，在55.0、65.0和75.0℃下保存30.0min后基本失活。可以看出E1比E2更耐高温，在45.0和55.0℃下温度稳定性更好。综合以上结果，短时间酶促反应时，谷氨酰胺酶的酶活在一定范围内随着温度升高而升高，但长时间酶促反应时，谷氨酰胺酶的酶活会降低。这是因为短时间内温度升高，
【参考文献】：
期刊论文
[1]谷胱甘肽的研究进展[J]. 王小巍,张红艳,刘锐,王东凯. 中国药剂学杂志(网络版). 2019(04)
[2]7-脱氧水仙环素的分离纯化及其体外抗肿瘤活性研究[J]. 万林,许喜林,杨林江,姜建国. 现代食品科技. 2019(04)
[3]鮟鱇鱼骨胶原多肽螯合钙的工艺优化[J]. 何云,汪有先,赵淑静,包建强. 食品研究与开发. 2018(21)
[4]两种谷氨酰胺酶的酶学特性研究[J]. 卢慧茵,王炜,崔春. 中国调味品. 2018(10)
[5]抗冻蛋白及其在食品中应用的研究进展[J]. 曹吉芳,曹慧,徐斐,袁敏,叶泰,于劲松. 工业微生物. 2018(03)
[6]丝胶抗冻肽在大肠杆菌中的重组表达及其抗冻活性初探[J]. 金泉,张莉,吴金鸿,汪少芸,李灵,王正武. 食品工业科技. 2018(21)
[7]猪皮胶原多肽螯合钙增加大鼠骨密度[J]. 许先猛,董文宾. 食品科学. 2017(23)
[8]营养教育和钙补充对孕中期钙缺乏和妊娠并发症的影响[J]. 李冉,李巍. 中国优生与遗传杂志. 2017(11)
[9]鳗鱼钙螯合肽制备工艺研究[J]. 吴长平,钟芳芳,霍国昌,赵谋明,苏国万. 现代食品科技. 2018(01)
[10]抗冻蛋白对预发酵冷冻面团中蛋白质特性及水分状态的影响[J]. 姬成宇,石媛媛,李梦琴,张剑,安艳霞,艾羽函. 食品科学. 2018(12)
博士论文
[1]γ-谷氨酰肽的酶法合成及其应用[D]. 杨娟.华南理工大学 2018
[2]牛骨降解菌的筛选及其发酵制备胶原多肽螯合钙的研究[D]. 刘丽莉.华中农业大学 2010
硕士论文
[1]谷氨酰胺酶合成γ-谷氨酰肽及其抗氧化性的研究[D]. 卢慧茵.华南理工大学 2019
[2]大豆肽钙螯合物的结合机理及其性质研究[D]. 王俊强.江南大学 2019
[3]酵母细胞通透性的调控及其合成谷胱甘肽研究[D]. 孙怡然.南昌大学 2018
[4]耦合树脂分离酶法合成谷胱甘肽研究[D]. 万伟建.南昌大学 2018
[5]鹿骨多肽螯合钙的制备方法与吸收的特性研究[D]. 毕景硕.吉林大学 2018
[6]鱼皮抗冻多肽的制备及其提高冷冻面团抗冻性的研究[D]. 孙丽洁.江南大学 2017
[7]谷胱甘肽电化学检测新方法的研究[D]. 吕赟.上海大学 2017
[8]利用重组钝齿棒杆菌高效表达γ-谷氨酰转肽酶及酶催化合成L-茶氨酸研究[D]. 和斐.江南大学 2016
[9]高磷酸化珠蚌肽钙的研究[D]. 温庆辉.南昌大学 2016
[10]E.coli与B.subtilis γ-谷氨酰基转移酶的重组表达及其催化合成L-茶氨酸的研究[D]. 黄锋.浙江大学 2016
本文编号：3585308
【文章来源】：华南理工大学广东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：89 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
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pH值对两种谷氨酰胺酶水解和转肽酶活的影响
华南理工大学硕士学位论文20有关[129]。由图2-1还可以看出，在pH值为3.0时，E1没有水解酶活，转肽相对酶活仍有25.18%，E2基本失活；随着pH值增加，E1和E2的水解相对酶活先逐渐增加，分别在pH值为11.0和10.0时达到峰值，随后下降；在pH值为12.0时E1水解相对酶活降至54.40%，E2水解相对酶活降至47.46%；二者的转肽相对酶活起初也随着pH值增加逐渐增加，在最适pH值时达到峰值后下降，在pH值为12.0时E1转肽相对酶活降至70.88%，E2转肽相对酶活降至15.54%。这些结果表明E1比E2对强酸、强碱条件具有更强的耐受性。图2-2pH值对两种谷氨酰胺酶水解和转肽酶活稳定性的影响Figure2-2EffectofpHonthestabilityofhydrolaseactivityandtranspeptidaseactivityoftwoglutaminases由图2-2可以看出，在pH值4.0-10.0范围内，两种谷氨酰胺酶的水解和转肽相对酶活均比较稳定，在此pH值范围内保持24.0h后水解和转肽相对酶活均能保持80%以上。杨娟发现解淀粉芽孢杆菌源谷氨酰胺酶在pH值6.0-11.0范围内的溶液中保存24.0h后其转肽相对酶活均可保持在90%以上[48]。杨成等人发现硝基还原假单胞菌源谷氨酰胺酶在pH值5.0-11.0范围内水解酶活基本保持稳定[134]。这些报道与本研究有些差异，可能是菌种来源不同、培养条件以及产物的分离纯化工艺不同和测定方法不同导致的。从图2-2还可以看出，在pH值12.0环境下保持24.0h后，两种谷氨酰胺酶均已失活，而在pH值11.0环境下保持24.0h后，E1水解相对酶活为93.61%，转肽相对酶活为91.90%，E2水解相对酶活为63.16%，转肽相对酶活为68.76%，这些结果表明E1比E2对强碱条件具有更强的耐受性。
第二章两种谷氨酰胺酶的酶学特性研究212.3.3温度对谷氨酰胺酶水解和转肽酶活的影响由图2-3可以看出，两种谷氨酰胺酶催化水解和转肽反应的最适反应温度不同，E1催化水解和转肽反应的最适反应温度为45.0和37.0℃，E2催化水解和转肽反应的最适反应温度为37.0和45.0℃，这和卢慧茵等人报道的有所不同，可能和菌种的培养条件以及产物的分离纯化工艺有关[129]。由图2-3还可以看出，二者的水解和转肽相对酶活起初随着反应温度的上升逐渐增加，在最适反应温度达到峰值后降低。E1在75.0℃时水解和转肽相对酶活保持在13.00%和31.04%，E2对反应温度更敏感，在75.0℃时已基本失活。这是因为适当的温度提高有利于反应的正向进行，而当温度过高时，蛋白变性导致酶的分子结构遭到破坏而失去活力[129]。图2-3温度对两种谷氨酰胺酶水解和转肽酶活的影响Figure2-3Effectoftemperatureonthehydrolaseactivityandtranspeptidaseactivityoftwoglutaminases由图2-4可以看出，E1在4.0、25.0、37.0、45.0和55.0℃下水解酶活稳定，保存240.0min仍能保持80%以上相对酶活，在65.0和75.0℃下保存30.0min后基本无水解酶活，转肽酶活在45.0℃下随着保存时间延长而降低，在55.0、65.0和75.0℃下保存30.0min后基本无转肽酶活；E2在4.0、25.0和37.0℃水解和转肽酶活都很稳定，在45.0℃下随着保存时间延长水解和转肽酶活都下降，在55.0、65.0和75.0℃下保存30.0min后基本失活。可以看出E1比E2更耐高温，在45.0和55.0℃下温度稳定性更好。综合以上结果，短时间酶促反应时，谷氨酰胺酶的酶活在一定范围内随着温度升高而升高，但长时间酶促反应时，谷氨酰胺酶的酶活会降低。这是因为短时间内温度升高，
【参考文献】：
期刊论文
[1]谷胱甘肽的研究进展[J]. 王小巍,张红艳,刘锐,王东凯. 中国药剂学杂志(网络版). 2019(04)
[2]7-脱氧水仙环素的分离纯化及其体外抗肿瘤活性研究[J]. 万林,许喜林,杨林江,姜建国. 现代食品科技. 2019(04)
[3]鮟鱇鱼骨胶原多肽螯合钙的工艺优化[J]. 何云,汪有先,赵淑静,包建强. 食品研究与开发. 2018(21)
[4]两种谷氨酰胺酶的酶学特性研究[J]. 卢慧茵,王炜,崔春. 中国调味品. 2018(10)
[5]抗冻蛋白及其在食品中应用的研究进展[J]. 曹吉芳,曹慧,徐斐,袁敏,叶泰,于劲松. 工业微生物. 2018(03)
[6]丝胶抗冻肽在大肠杆菌中的重组表达及其抗冻活性初探[J]. 金泉,张莉,吴金鸿,汪少芸,李灵,王正武. 食品工业科技. 2018(21)
[7]猪皮胶原多肽螯合钙增加大鼠骨密度[J]. 许先猛,董文宾. 食品科学. 2017(23)
[8]营养教育和钙补充对孕中期钙缺乏和妊娠并发症的影响[J]. 李冉,李巍. 中国优生与遗传杂志. 2017(11)
[9]鳗鱼钙螯合肽制备工艺研究[J]. 吴长平,钟芳芳,霍国昌,赵谋明,苏国万. 现代食品科技. 2018(01)
[10]抗冻蛋白对预发酵冷冻面团中蛋白质特性及水分状态的影响[J]. 姬成宇,石媛媛,李梦琴,张剑,安艳霞,艾羽函. 食品科学. 2018(12)
博士论文
[1]γ-谷氨酰肽的酶法合成及其应用[D]. 杨娟.华南理工大学 2018
[2]牛骨降解菌的筛选及其发酵制备胶原多肽螯合钙的研究[D]. 刘丽莉.华中农业大学 2010
硕士论文
[1]谷氨酰胺酶合成γ-谷氨酰肽及其抗氧化性的研究[D]. 卢慧茵.华南理工大学 2019
[2]大豆肽钙螯合物的结合机理及其性质研究[D]. 王俊强.江南大学 2019
[3]酵母细胞通透性的调控及其合成谷胱甘肽研究[D]. 孙怡然.南昌大学 2018
[4]耦合树脂分离酶法合成谷胱甘肽研究[D]. 万伟建.南昌大学 2018
[5]鹿骨多肽螯合钙的制备方法与吸收的特性研究[D]. 毕景硕.吉林大学 2018
[6]鱼皮抗冻多肽的制备及其提高冷冻面团抗冻性的研究[D]. 孙丽洁.江南大学 2017
[7]谷胱甘肽电化学检测新方法的研究[D]. 吕赟.上海大学 2017
[8]利用重组钝齿棒杆菌高效表达γ-谷氨酰转肽酶及酶催化合成L-茶氨酸研究[D]. 和斐.江南大学 2016
[9]高磷酸化珠蚌肽钙的研究[D]. 温庆辉.南昌大学 2016
[10]E.coli与B.subtilis γ-谷氨酰基转移酶的重组表达及其催化合成L-茶氨酸的研究[D]. 黄锋.浙江大学 2016
本文编号：3585308
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