鸡卵黄免疫球蛋白Fab片段的制备及其抗炎活性研究

发布时间：2022-10-19 18:56

　　炎症是一种针对感染或损伤的适应性免疫反应。适度的炎症反应对机体是有益的,但当发生失调慢性炎症反应时,会引起一系列慢性疾病（癌症,动脉粥样硬化,类风湿关节炎等）。免疫球蛋白G（Ig G）是一种从健康哺乳动物血液中获得的抗体,在脂多糖/植物凝集素诱导的细胞模型系统中表现出显著的抗炎症效果。鸡蛋黄来源卵黄免疫球蛋白（IgY）在结构和Ig G功能上相似,但是IgY比Ig G获取的原材料简单,产量高,具有对哺乳动物抗原有很高的亲和力以及不与类风湿因子反应等特点。其IgY粗提物广泛用于免疫活性和抗炎症活性中。然而IgY的Fc片段不能激活哺乳动物体系相应的免疫调控机制,提高了IgY成为哺乳动物过敏原的风险。目前用来分离纯化Fab和Fc片段方法常常多种色谱柱的联合使用,方法昂贵复杂且费时。因此本论文在研究两种蛋白酶酶解IgY活性片段的基础上,提出了一种高效,绿色环保的Fab片段分离纯化方法,制备高纯度Fab片段。比较Fab片段和IgY结构的差异,进一步阐述Fab片段和IgY在LPS（脂多糖）诱导的RAW264.5炎症模型中的抗炎症功效。研究内容结果如下:第一,本章研究了木瓜蛋白酶和胃蛋白酶分解IgY得... 

【文章页数】：120 页

【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
缩略语表
第一章 绪论
    1 IgY的结构与活性片段
    2 Fab和Fc片段的制备
        2.1 IgY的酶解方式
            2.2.1 木瓜蛋白酶酶解
            2.2.2 胃蛋白酶酶解
        2.2 Fab片段和Fc片段的分离纯化
            2.2.1 盐析
            2.2.2 超滤法
            2.2.3 色谱法
            2.2.4 Gradiflow技术
    3 IgY及其Fab片段抗炎症活性研究
        3.1 炎症的形成机理
        3.2 巨噬细胞的免疫调节
        3.3 哺乳动物免疫球蛋白IVIg和巨噬细胞的相互作用
            3.3.1 IVIg与巨噬细胞的膜表面受体的相互作用
            3.3.2 血红素加氧酶-1通路
            3.3.3 IVIg毒中和作用
        3.4 Fab的抗炎症活性研究
        3.5 IgY的应用研究进展
    4 选题意义
    5 研究内容
第二章 两种蛋白酶酶解制备IgY活性片段研究
    1 材料与方法
        1.1 材料与试剂
        1.2 主要仪器
        1.3 试验方法
            1.3.1 IgY的制备
            1.3.2 IgY的表征
            1.3.2 蛋白质的木瓜蛋白酶酶解条件优化
            1.3.3 胃蛋白酶酶解条件优化
            1.3.4 Western blotting试验
            1.3.5 胃蛋白酶解制备Fab片段的分离纯化
    2 结果与分析
        2.1 IgY非还原型SDS-PAGE电泳图
        2.2 SEC-HPLC分析IgY样品纯度
        2.3 木瓜蛋白酶酶解条件优化
            2.3.1 IgY和木瓜蛋白酶用量比
            2.3.2 半胱氨酸的用量
            2.3.3 酶解时间
            2.3.4 酶解条件的优化
        2.4 胃蛋白酶酶解条件优化
            2.4.1 IgY与胃蛋白酶质量比对酶解效率的影响
            2.4.2 酶解时间对酶解效率的影响
        2.5 酶解溶液的western blotting分析
        2.6 胃蛋白酶解制备Fab片段的分离纯化
    3 讨论
    4 本章小结
第三章 IgY木瓜蛋白酶酶解Fab片段的分离纯化
    1 材料与方法
        1.1 材料与试剂
        1.2 主要仪器
        1.3 试验方法
            1.3.1 酶解溶液的制备
            1.3.2 IgY酶解溶液的超滤浓缩
            1.3.3 硫酸铵和氯化钠盐析对木瓜蛋白酶酶解溶液的影响
            1.3.4 阴离子交换色谱柱分离IgY木瓜蛋白酶酶解片段
            1.3.5 SDS-PAGE分析
            1.3.6 蛋白质浓度测定
            1.3.7 Western blotting分析
            1.3.8 MALDI-TOF/TOF MS分析
    2 结果与讨论
        2.1 超滤对IgY木瓜蛋白酶酶解片段的影响
        2.2 盐析对IgY木瓜蛋白酶酶解溶液的影响
        2.3 阴离子交换色谱柱分离IgY木瓜蛋白酶酶解片段
            2.3.1 离子强度对阴离子交换色谱柱分离效果的影响
            2.3.2 pH值对阴离子交换色谱柱分离效果的影响
            2.3.3 IgY木瓜蛋白酶酶解片段的分离纯化
            2.3.4 MALDI-TOF/TOF MS定性未知片段
        2.4 IgY酶解片段纯度和得率计算
    3 讨论
    4 小结
第四章 IgY及 Fab片段的蛋白构象与理化性质研究
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 主要试剂
            1.1.2 主要仪器
        1.2 方法
            1.2.1 傅里叶变换红外光谱(FTIR)
            1.2.2 圆二色谱(CD)分析
            1.2.3 差示扫描量热分析(DSC)
            1.2.4 紫外可见(UV-Vis)光谱扫描
            1.2.5 内源性荧光光谱分析
            1.2.6 表面疏水性的测定
            1.2.7 分子排阻色谱分析(SEC-HPLC)
            1.2.8 动态光散射(DLS)粒径分析
            1.2.9 Zeta电位测定
            1.2.10 数据分析
    2 结果与分析
        2.1 傅里叶变换红外光谱分析
        2.2 圆二色谱分析
        2.3 差示扫描量热分析
        2.4 荧光光谱分析
        2.5 紫外光谱分析
        2.6 蛋白质表面疏水性
        2.7 蛋白质的SEC-HPLC分析
        2.8 粒径分布
        2.9 蛋白表面电荷分析
    3 讨论
    4 本章小结
第五章 IgY及 Fab片段对脂多糖诱导RAW264.7 细胞的炎症的影响
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 主要试剂
            1.1.2 主要仪器
        1.2 方法
            1.2.1 细胞培养
            1.2.2 细胞活性的测定
            1.2.3 炎症因子的测定
            1.2.4 RT-PCR分析
            1.2.5 数据分析
    2 结果与分析
        2.1 RAW264.7巨噬细胞培养
        2.2 细胞活性的测定
        2.3 LPS诱导炎症细胞的活性
        2.4 一氧化氮(NO)的测定
        2.5 前列腺素E2(PGE2)含量的测定
        2.6 COX-2 mRNA表达
        2.7 iNOS mRNA的表达
        2.8 TNF-α含量的测定
        2.9 IL-6含量的测定
        2.10 IL-10含量的测定
    3 讨论
    4 小结
第六章 Fab片段对NF-κB和 MAPK信号通路关键蛋白的调控
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 主要试剂
            1.1.2 主要仪器
        1.2 方法
            1.2.1 细胞培养
            1.2.2 细胞活性测定
            1.2.3 qRT-PCR
            1.2.4 NF-κB和 MAPKs通路调节蛋白检测
            1.2.5 激光共聚焦分析
            1.2.6 数据分析
    2 结果与分析
        2.1 细胞活性的测定
        2.2 qRT-PCR
        2.3 激光共聚焦分析
        2.4 NF-κB和 MAKPs调节蛋白检测
    3 讨论
    4 小结
第七章 结论与展望
    1 结论
    2 创新点
    3 展望
参考文献
附录 攻读硕士学位期间研究成果
致谢



本文编号：3693925