聚乙二醇定点修饰β-乳球蛋白巯基对其结构及致敏性的影响
发布时间：2023-04-26 18:10
牛乳过敏是全球普遍关注的食品安全问题之一。β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-LG)是导致牛乳过敏反应的重要的过敏原之一,采用共价修饰降低β-LG致敏性已然是当前国际乳制品加工技术的研究热点。有研究表明β-LG抗原性同时受线性表位和构象表位影响,若共价修饰发生在不同位点会对蛋白构象及抗原性产生不同影响。然而目前已有文献中常用的共价修饰大都属于多位点的随机修饰,存在修饰位点选择性低、稳定性不理想、修饰产物不均一等诸多问题,在β-LG致敏性的机理研究上存有较大约束性。为明晰不同位点共价修饰对β-LG抗原性的影响,实现共价修饰对β-LG抗原性的有效调控,需采用定点修饰技术以制备均一化修饰产物,针对特定基团或位点进行修饰以从机理上探究不同位点对蛋白致敏性的影响。故本研究首次采用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)定点修饰方法针对β-LG第121位游离巯基,通过使用不同分子量5kDa及10 kDa单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(mPEG-MAL)对其进行定点修饰,制备纯化得到均一化PEG-β-LG单修饰产物,并对修饰前后蛋白结构及致敏性变化进行探究,通过实验结合理...
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 前言
1.1 牛乳过敏
1.2 β-乳球蛋白概述
1.2.1 β-乳球蛋白致敏性
1.2.2 常用β-LG过敏原改性方法
1.3 聚乙二醇概述
1.3.1 聚乙二醇修饰的安全性
1.3.2 聚乙二醇修饰在食品行业的应用
1.3.3 聚乙二醇定点修饰位点的选择
1.3.4 常用的聚乙二醇定点修饰位点
1.4 研究意义、研究内容及创新点
1.4.1 研究意义
1.4.2 研究内容
1.4.3 创新点
第2章 PEG定点修饰β-LG巯基产物的制备
2.1 引言
2.2 材料与设备
2.2.1 材料与试剂
2.2.2 仪器与设备
2.3 实验方法
2.3.1 mPEG-MAL修饰β-LG原理
2.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.3.3 凝胶过滤色谱分析
2.3.4 修饰反应条件反应优化
2.3.5 数据统计与分析
2.4 结果与分析
2.4.1 β-LG与mPEG-MAL不同反应摩尔比
2.4.2 不同反应时间
2.4.3 不同pH
2.4.4 不同TCEP添加量
2.4.5 不同乙醇添加量
2.5 修饰度测定
2.6 本章小结
第3章 PEG定点修饰β-LG巯基产物的分离纯化与修饰位点鉴定
3.1 引言
3.2 材料与试剂
3.2.1 材料与试剂
3.2.2 仪器与设备
3.3 实验方法
3.3.1 阳离子交换层析
3.3.2 蛋白浓度测定
3.3.3 游离巯基含量测定
3.3.4 SDS-PAGE
3.3.5 高效凝胶过滤色谱分析
3.3.6 基质辅助激光解吸附质谱(MALDI-TOF MS)
3.3.7 数据统计与分析
3.4 结果与分析
3.4.1 阳离子交换层析分离纯化
3.4.2 修饰产物纯度鉴定
3.4.3 基质辅助激光解吸附质谱(MALDI-TOF MS)分析
3.4.4 修饰位点鉴定
3.5 本章小结
第4章 PEG定点修饰β-LG巯基对其致敏性及结构变化的影响
4.1 引言
4.2 材料与设备
4.2.1 材料
4.2.2 仪器与设备
4.3 实验方法
4.3.1 间接竞争ELISA测定抗原性
4.3.2 圆二色光谱
4.3.3 内源性荧光光谱
4.3.4 表面疏水性
4.3.5 数据统计与分析
4.4 实验结果与分析
4.4.1 PEG修饰β-LG前后抗原性变化
4.4.2 PEG修饰β-LG前后二级结构变化
4.4.3 PEG修饰β-LG前后三级结构变化
4.4.4 结构变化与致敏性关系分析
4.5 本章小结
第5章 结果讨论与展望
5.1 结果讨论
5.2 展望
致谢
参考文献
攻读学位期间的研究成果
本文编号：3801959
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第1章 前言
1.1 牛乳过敏
1.2 β-乳球蛋白概述
1.2.1 β-乳球蛋白致敏性
1.2.2 常用β-LG过敏原改性方法
1.3 聚乙二醇概述
1.3.1 聚乙二醇修饰的安全性
1.3.2 聚乙二醇修饰在食品行业的应用
1.3.3 聚乙二醇定点修饰位点的选择
1.3.4 常用的聚乙二醇定点修饰位点
1.4 研究意义、研究内容及创新点
1.4.1 研究意义
1.4.2 研究内容
1.4.3 创新点
第2章 PEG定点修饰β-LG巯基产物的制备
2.1 引言
2.2 材料与设备
2.2.1 材料与试剂
2.2.2 仪器与设备
2.3 实验方法
2.3.1 mPEG-MAL修饰β-LG原理
2.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.3.3 凝胶过滤色谱分析
2.3.4 修饰反应条件反应优化
2.3.5 数据统计与分析
2.4 结果与分析
2.4.1 β-LG与mPEG-MAL不同反应摩尔比
2.4.2 不同反应时间
2.4.3 不同pH
2.4.4 不同TCEP添加量
2.4.5 不同乙醇添加量
2.5 修饰度测定
2.6 本章小结
第3章 PEG定点修饰β-LG巯基产物的分离纯化与修饰位点鉴定
3.1 引言
3.2 材料与试剂
3.2.1 材料与试剂
3.2.2 仪器与设备
3.3 实验方法
3.3.1 阳离子交换层析
3.3.2 蛋白浓度测定
3.3.3 游离巯基含量测定
3.3.4 SDS-PAGE
3.3.5 高效凝胶过滤色谱分析
3.3.6 基质辅助激光解吸附质谱(MALDI-TOF MS)
3.3.7 数据统计与分析
3.4 结果与分析
3.4.1 阳离子交换层析分离纯化
3.4.2 修饰产物纯度鉴定
3.4.3 基质辅助激光解吸附质谱(MALDI-TOF MS)分析
3.4.4 修饰位点鉴定
3.5 本章小结
第4章 PEG定点修饰β-LG巯基对其致敏性及结构变化的影响
4.1 引言
4.2 材料与设备
4.2.1 材料
4.2.2 仪器与设备
4.3 实验方法
4.3.1 间接竞争ELISA测定抗原性
4.3.2 圆二色光谱
4.3.3 内源性荧光光谱
4.3.4 表面疏水性
4.3.5 数据统计与分析
4.4 实验结果与分析
4.4.1 PEG修饰β-LG前后抗原性变化
4.4.2 PEG修饰β-LG前后二级结构变化
4.4.3 PEG修饰β-LG前后三级结构变化
4.4.4 结构变化与致敏性关系分析
4.5 本章小结
第5章 结果讨论与展望
5.1 结果讨论
5.2 展望
致谢
参考文献
攻读学位期间的研究成果
本文编号：3801959
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/qgylw/3801959.html
