荧光假单胞菌W3的分离及其胞外蛋白产物分析
发布时间：2023-08-20 09:56
冷链贮运的发展使得原料乳中绝大部分外源微生物的生长得到了有效的抑制,在低温条件下嗜冷菌能够继续生长繁殖逐渐成为原料乳中的优势微生物。以假单胞菌为代表的部分嗜冷菌能够分泌一些耐热的蛋白酶和脂肪酶,在原料乳常规的加热灭菌处理后依然能够保持部分活性,残存的酶会对乳中的蛋白质和脂肪等营养成分进行分解,导致乳制品的品质降低。本论文从黑龙江地区的原料乳中筛选出一株高产胞外蛋白酶和胞外脂肪酶的嗜冷菌,并对其分泌的蛋白酶和脂肪酶的耐热性进行研究。利用蛋白质组学技术对该菌株的胞外蛋白质类物质进行鉴定和生物信息学分析。从黑龙江地区采集的原料乳运用平板画线法分理出20株嗜冷菌,将分离出的20株嗜冷菌分别利用罗丹明B平板法和脱脂乳平板法鉴定其产脂肪酶和蛋白酶的能力,最终筛选出一株产蛋白酶和脂肪酶能力最强的菌株,经16S rDNA鉴定该菌株为荧光假单胞菌,命名为荧光假单胞菌W3。荧光假单胞菌W3分泌的胞外蛋白酶和胞外脂肪酶具有耐热性,经过65℃水浴30 min后,脂肪酶的残余率为45.69%、蛋白酶的残余率为47.76%;90℃水浴5 min后,脂肪酶的残余率为26.32%、蛋白酶的残余率为35.91%;137...
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
1.1 课题的研究背景与目的意义
1.2 原料乳中的外源微生物多样性
1.3 原料乳中嗜冷菌概述
1.3.1 嗜冷菌的定义及来源
1.3.2 原料乳中的优势嗜冷菌
1.4 原料乳中嗜冷假单胞菌的潜在危害
1.4.1 菌体数目超标造成的危害
1.4.2 菌体代谢产物的危害
1.4.3 潜在致病性
1.5 嗜冷菌蛋白酶的研究进展
1.6 嗜冷菌脂肪酶的研究进展
1.7 蛋白质组学技术在微生物领域的应用
1.7.1 蛋白质组学指导菌株生物合成
1.7.2 蛋白质组学指导菌株耐受性改造
1.8 主要研究内容
1.9 技术路线
第2章 材料和方法
2.1 材料及仪器
2.1.1 材料与试剂
2.1.2 实验仪器
2.2 原料乳中优势嗜冷菌产耐热蛋白酶/脂肪酶的研究
2.2.1 原料乳中嗜冷菌的分离纯化
2.2.2 罗丹明B平板法鉴定荧光假单胞的产脂肪酶能力
2.2.3 脱脂乳平板法鉴定荧光假单胞的产蛋白酶能力
2.2.4 优势嗜冷菌的16S rDNA鉴定
2.2.5 高产蛋白酶/脂肪酶嗜冷菌生长能力测定
2.2.6 蛋白酶活力测定
2.2.7 脂肪酶活力测定
2.2.8 菌株耐热性测定
2.2.9 游离氨基酸含量测定
2.3 荧光假单胞菌W3培养液的蛋白质组学分析
2.3.1 蛋白质提取
2.3.2 蛋白质提取质控
2.3.3 蛋白酶解
2.3.4 肽段标记
2.3.5 肽段分离
2.3.6 高效液相色谱分析
2.3.7 质谱检测
2.4 生物信息学分析
2.4.1 蛋白聚类分析
2.4.2 蛋白质GO功能注释分析
2.4.3 Pathway富集分析
2.5 数据处理与统计分析
第3章 优势嗜冷菌的筛选及其产酶特性研究
3.1 原料乳中高产蛋白酶/脂肪酶嗜冷菌的筛选
3.2 3号菌株的16S rDNA测定
3.3 荧光假单胞菌W3生长能力测定
3.4 荧光假单胞菌W3分泌胞外酶能力测定
3.5 荧光假单胞菌W3菌数与酶活随时间变化研究
3.6 荧光假单胞菌W3菌株耐热能力测定
3.7 荧光假单胞菌W3分泌胞外蛋白酶和脂肪酶耐热性研究
3.8 UHT条件灭菌后菌液的酶活力变化研究
3.9 本章小结
第4章荧光假单胞菌W3分泌胞外蛋白质组学分析
4.1 蛋白质组学取样点的选择
4.2 样品蛋白的提取
4.3 蛋白定量重复性分析
4.4 蛋白质鉴定结果分析
4.4.1 鉴定出蛋白质和多肽大小分析
4.4.2 鉴定出蛋白质特异性肽段分析
4.5 蛋白质iTRAQ分析
4.6 W3菌株分泌乳制品潜在危害蛋白
4.6.1 W3菌株分泌的胞外蛋白酶
4.6.2 W3菌株分泌的胞外脂肪酶
4.6.3 W3菌株分泌的肽酶
4.6.4 W3菌株分泌的溶菌酶
4.7 差异蛋白的表达聚类分析
4.8 差异蛋白的GO功能注释分析
4.8.1 全差异蛋白的GO富集分析
4.8.2 原料乳潜在危害蛋白的GO分析
4.9 差异蛋白的Pathway富集分析
4.10 差异蛋白COG注释分析
4.11 本章小结
结论
参考文献
附录
攻读硕士学位期间发表的论文及其它成果
致谢
本文编号：3842992
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
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摘要
Abstract
第1章 绪论
1.1 课题的研究背景与目的意义
1.2 原料乳中的外源微生物多样性
1.3 原料乳中嗜冷菌概述
1.3.1 嗜冷菌的定义及来源
1.3.2 原料乳中的优势嗜冷菌
1.4 原料乳中嗜冷假单胞菌的潜在危害
1.4.1 菌体数目超标造成的危害
1.4.2 菌体代谢产物的危害
1.4.3 潜在致病性
1.5 嗜冷菌蛋白酶的研究进展
1.6 嗜冷菌脂肪酶的研究进展
1.7 蛋白质组学技术在微生物领域的应用
1.7.1 蛋白质组学指导菌株生物合成
1.7.2 蛋白质组学指导菌株耐受性改造
1.8 主要研究内容
1.9 技术路线
第2章 材料和方法
2.1 材料及仪器
2.1.1 材料与试剂
2.1.2 实验仪器
2.2 原料乳中优势嗜冷菌产耐热蛋白酶/脂肪酶的研究
2.2.1 原料乳中嗜冷菌的分离纯化
2.2.2 罗丹明B平板法鉴定荧光假单胞的产脂肪酶能力
2.2.3 脱脂乳平板法鉴定荧光假单胞的产蛋白酶能力
2.2.4 优势嗜冷菌的16S rDNA鉴定
2.2.5 高产蛋白酶/脂肪酶嗜冷菌生长能力测定
2.2.6 蛋白酶活力测定
2.2.7 脂肪酶活力测定
2.2.8 菌株耐热性测定
2.2.9 游离氨基酸含量测定
2.3 荧光假单胞菌W3培养液的蛋白质组学分析
2.3.1 蛋白质提取
2.3.2 蛋白质提取质控
2.3.3 蛋白酶解
2.3.4 肽段标记
2.3.5 肽段分离
2.3.6 高效液相色谱分析
2.3.7 质谱检测
2.4 生物信息学分析
2.4.1 蛋白聚类分析
2.4.2 蛋白质GO功能注释分析
2.4.3 Pathway富集分析
2.5 数据处理与统计分析
第3章 优势嗜冷菌的筛选及其产酶特性研究
3.1 原料乳中高产蛋白酶/脂肪酶嗜冷菌的筛选
3.2 3号菌株的16S rDNA测定
3.3 荧光假单胞菌W3生长能力测定
3.4 荧光假单胞菌W3分泌胞外酶能力测定
3.5 荧光假单胞菌W3菌数与酶活随时间变化研究
3.6 荧光假单胞菌W3菌株耐热能力测定
3.7 荧光假单胞菌W3分泌胞外蛋白酶和脂肪酶耐热性研究
3.8 UHT条件灭菌后菌液的酶活力变化研究
3.9 本章小结
第4章荧光假单胞菌W3分泌胞外蛋白质组学分析
4.1 蛋白质组学取样点的选择
4.2 样品蛋白的提取
4.3 蛋白定量重复性分析
4.4 蛋白质鉴定结果分析
4.4.1 鉴定出蛋白质和多肽大小分析
4.4.2 鉴定出蛋白质特异性肽段分析
4.5 蛋白质iTRAQ分析
4.6 W3菌株分泌乳制品潜在危害蛋白
4.6.1 W3菌株分泌的胞外蛋白酶
4.6.2 W3菌株分泌的胞外脂肪酶
4.6.3 W3菌株分泌的肽酶
4.6.4 W3菌株分泌的溶菌酶
4.7 差异蛋白的表达聚类分析
4.8 差异蛋白的GO功能注释分析
4.8.1 全差异蛋白的GO富集分析
4.8.2 原料乳潜在危害蛋白的GO分析
4.9 差异蛋白的Pathway富集分析
4.10 差异蛋白COG注释分析
4.11 本章小结
结论
参考文献
附录
攻读硕士学位期间发表的论文及其它成果
致谢
本文编号：3842992
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