若干锌指蛋白质识别（亚）端粒DNA的结构生物学研究

发布时间：2020-04-15 23:24

【摘要】：端粒长度的动态平衡决定着细胞增殖潜能,对于相应的细胞功能至关重要。端粒长度缩短过程主要有细胞分裂过程中端粒缩短和端粒修剪(Telomere trimming)快速调控。端粒长度延长过程则是通过激活端粒酶活性或端粒延伸替代机制(ALT)延长反应。端粒缩短和端粒延长之间动态平衡决定干细胞和生殖细胞的端粒长度,表明端粒长度应当受到严格控制,而此过程中相关端粒结合蛋白起到重要作用。目前已知直接结合端粒重复序列蛋白质组包括shelterin复合物的三个成员(TRF1,TRF2和POT1结合单链DNA)和HOT1蛋白质。而本文主要分三部分阐述若干锌指蛋白质识别(亚)端粒DNA的结构生物学研究。论文第一部分为人源TZAP蛋白质(ZBTB48,更名为端粒相关锌指蛋白质)与端粒DNA TTAGGG结构与功能的研究。TZAP蛋白质可直接结合到端粒双链DNA TTAGGG序列并诱发端粒修剪过程,参与端粒长度调控。TZAP蛋白质由N-端BTB/POZ结构域和C-端的11个串联C2H2锌指(Znf1-11)组成。研究发现TZAP对端粒DNA TTAGGG结合能力定位于第9-11个锌指Znf9-11,并且进一步研究表示结合能力主要由ZnF1 1贡献。虽然C2H2锌指结合DNA的特异性和机制已被深入研究,但TZAP是第一个直接结合端粒DNA的C2H2锌指蛋白质。端粒结合蛋白TRF1,TRF2和HOT1以homeodomains结构域识别双链端粒DNA,且不识别亚端粒DNA,而TZAP蛋白质偏好性地识别不同类型亚端粒DNA。因此,TZAP特异性识别(亚)端粒DNA的机制仍需进一步研究。TZAP_ZnF9-11-C蛋白质与18bp TTAGGG双链核苷酸复合物晶体结构证明第11个锌指Znf1 1负责识别G4G5G6三联体,C末端保守氨基酸负责识别T2A3,该复合物晶体结构为TZAP识别端粒DNA提供分子基础。论文第二部分为ZBTB10、Znf827、TR4/COUP-TF2 C4等锌指蛋白质与(亚)端粒序列结构与功能的研究。Dennis Kappei课题组筛选得到TZAP蛋白质时,获得另一个端粒DNA结合蛋白质ZBTB10。ZBTB10与TZAP(ZBTB48)皆属于Kruppel-like C2H2锌指蛋白质家族,其含有N端BTB/POZ结构域和C端两个串联C2H2(Znf1-2)锌指结构域。分析ZBTB10核酸序列,发现在两个串联C2H2锌指结构域后还存在一个保守C2HR类锌指结构域。通过荧光偏振实验发现C2HR类锌指对于ZBTB10蛋白质识别端粒序列至关重要。因此,旨在解析ZBTB10蛋白质与端粒DNA高分辨率复合物晶体结构,为阐述ZBTB10蛋白质识别端粒DNA的特异性提供分子基础。目前已获得初筛晶体,仍需进一步重复和优化晶体。澳大利亚悉尼大学HildaAPickett研究组发现锌指蛋白质Znf827能够募集NuRD(Nucleosome Remodeling and histone Deacetylase complex)复合物至ALT端粒区域,促进ALT机制发生。课题组孙爱爱博士阐述Znf827如何募集NuRD复合物,但Znf827-NuRD复合物如何定位到ALT端粒区域仍有待研究。Hilda A Pickett在文章中提出TR4和COUP-TF2两个孤儿核受体(orphan nuclear receptor)蛋白质可能在募集Znf827-NuRD中起重要作用。另一方面,关注到Znf827蛋白质自身包含9个C2H2(Znf1-9)锌指,可能也具有ALT端粒DNA结合能力。此课题期望通过解析TR4/COUP-TF2 C4锌指、Znf827与(亚)端粒DNA复合物晶体结构,阐述其定位于ALT端粒区域的结构基础。目前已获得初筛晶体,仍需进一步重复和优化晶体。论文第三部分初步探索AEBP2锌指蛋白质结构与功能。多梳抑制家族复合物PRC2的游离组分AEBP2与核心组分RBBP4和SUZ12相互作用,从而进一步增加PRC2核心复合物稳定性,同时也一定程度地提高PRC2多元复合物酶活性。AEBP2串联三个C2H2锌指结构域C端存在一段富含精氨酸和赖氨酸区域(RRK区域),与TZAP蛋白质C端保守序列相似,由此猜测AEBP2 RRK区域可能对于AEBP2蛋白质识别dsDNA有重要作用。本课题期望解析AEBP2锌指蛋白质与DNA复合物晶体结构,并且阐述其分子机制。目前已通过荧光偏振实验证明RRK区域对于AEBP2蛋白质结合T1 DNA序列尤为重要,仍需进一步获得复合物晶体结构。
【图文】：

端粒,结构示意图,染色体,线性

核生物线性染色体末端，由众多重复核酸序列以及相的蛋白质－ＤＮＡ复合结构。端粒保护使线性染色体机制识别为ＤＮＡ损伤从而避免部分损伤修复机制破性。大多数原核生物具有圆形染色体而非线性染色体，分细菌（例如链霉菌，农杆菌和疏螺旋体中）染色体它们在结构和功能上与真核生物线性染色体末端端构呈现出两种形式：与线性染色体末端的端粒结合蛋体末端自身形成单链ＤＮＡ发夹环。在哺乳动物细胞ＤＮＡ由大约１０００－２５００个重复ＤＮＡ序列ＴＴＡＧＧＧ重复核酸序列ＡＡＴＣＣＣ。端粒ＤＮＡ大部分区域为双为Ｇ链，另一条与之互补且富含Ｃ／Ａ链称为Ｃ链。Ｇ式结尾，形成３’－ｏｖｅｒｈａｎｇ。３’－ｏｖｅｒｈａｎｇ可以侵入到配对，形成Ｔ－ｌｏｏｐ结构⑴（图丨．丨）。研宄表明，端Ｔ序列的Ｇ链能够形成分子内或分子间鸟嘌呤四联体级结构较线性染色体更加稳定。逦逡逑

端粒,核酸序列,组成成分,细胞系

端粒ＤＮＡ重复序列在不同种属中具有偏好性，哺乳动物的端粒重复核酸序逡逑列一般是ＴＴＡＧＧＧ［３］，且ＤＮＡ重复序列的长度会有些许差异，如人类端粒重复逡逑核酸片段大约１０－１５邋ｋｂ，而小鼠端粒重复核酸片段大约２０－５０邋ｋｂ。如图１．２所示，逡逑即为不同细胞系中端粒重复核酸序列组成［４］。由此可见，除了典型端粒重复核酸逡逑序列ＴＴＡＧＧＧ以外，还存在着许多亚端粒类型，常见的为ＴＣＡＧＧＧ，ＴＴＧＧＧＧ，逡逑ＴＴＣＧＧＧ等。逡逑ＷＩ３８－ＶＡ１３／２ＲＡ逦ＨｅＬａ逡逑（ＡＬＴ）逦（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）逡逑叙逦：：：啊逡逑ｅ－ＣＴ？ＣＧＧ逡逑２．７％逦■邋■邋ＴＧＡＧＧＧ逡逑？ＴＴＧＧＧＧ逡逑Ｓ＞ＴＡＡＧＧＧ逡逑：：＝逡逑图１．２不同细胞系中端粒重复核酸序列的组成成分Ｗ逡逑端粒与线性染色体体内定位、末端保护、复制分裂密切相关，影响细胞的分逡逑裂、生长、凋亡、衰老、分化和永生化［５，６】等生命过程。不同类型细胞的增殖次逡逑数有所差别，干细胞、生殖细胞以及肿瘤细胞能够无限增殖，而体细胞的端粒长逡逑度会随着ＤＮＡ复制而缩短，当细胞分裂增殖的次数达到上限时，端粒的长度缩逡逑短到极限，遗传信息大量丢失，，无法维持细胞正常的生命周期，细胞将停止复制逡逑增殖走向衰老或死亡［７＿９］。细胞衰老与许多癌症密切相关
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q75

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