CAS9诱导人源细胞基因组DNA损伤的机制研究
发布时间：2021-06-14 11:07
研究背景Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR）/CRISPR associated protein9（CAS9）是一种来自于细菌的抵御病毒的免疫防御系统,后来被开发成具有高效靶向性和特异性的基因编辑技术,目前广泛应用于基因敲除,定向突变,基因激活,疾病模型构建和基因治疗等。基于CRISPR/CAS9的人类疾病基因治疗的临床应用现已取得重大进展,其中一些也正在进入临床试验阶段。而作为外源蛋白的CAS9在应用到人类疾病治疗时的安全风险也一直倍受人关注。有研究报道在健康人体中发现了抗CAS9的抗体和抗原反应性T细胞,说明CAS9有潜在的免疫风险。此外基因编辑会导致基因组不稳定性,近几年多篇研究报道基因编辑可以引起广泛的染色体缺失,基因重排或突变,并且CRISPR技术可以激活p53介导的损伤反应,但具体机制不是十分清楚。大部分研究主要关注在外源gRNA存在条件下,DNA损伤反应的激活,而CAS9在缺乏gRNA时对基因组稳定性是否存在影响有待进一步研究。研究方法1.利用Tet-on系统和慢病毒载体分别构建...
【文章来源】：南方医科大学广东省
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１：?Ｈ９中，Ｔｅｔ－ＣＡＳ９在Ｄｏｘｙ处理后２４ｈ、４８ｈ均可以诱导ＤＮＡ损伤通路相关蛋白的??表达
ｙ?ｉｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ??ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ??３．３?ＣＡＳ９能激活ｐ５３信号通路??我们利用Ｑｐｃｒ对ｐ５３凋亡通路的下游靶基因的ｍＲＮＡ水平进行检测，结果发??现ＮＯＸＡ、ｐ２１、ＰＥＲＰ及ＰＵＭＡ水平均明显升高。说明ＣＡＳ９单独的过表达能激??活ｐ５３彳Ｓ号通路。??Ｃ??．２?１５，??％??Ｉ．?？ＣＴＬ??ｓ?＂ＣＡＳ９?ｒ??ａ：??ｅ?ｈ?＊??．１５＇?Ｉ?１?＊＊??＾?ｏＷｉ?ｍ???ＮＯＸＡ?ｐ２１?ＰＥＲＰ?ＰＵＭＡ??图１－３：?ｐ５３凋亡通路下游靶基因ＮＯＸＡ、ｐ２１、ＰＥＲＰ及ＰＵＭＡ的ｍＲＮＡ水平均明显升尚??２１??
ｎｃｒｅａｓｅｄ．??３．４免疫荧光实验检测Ｈ９中过表达ＣＡＳ９对丫?Ｈ２ＡＸ焦点数量的影响??当ＤＮＡ双链断裂损伤发生时，Ｈ２ＡＸ会被迅速磷酸化，并在荧光显微下形??成一个一个的焦点，是检测ＤＳＢ的重要标志物。我们通过免疫荧光实验看到，??与不加Ｄｏｘｙ的对照组相比，Ｄｏｘｙ处理的Ｈ９细胞中ＹＨ２ＡＸ焦点的数量显著增??多，并且具有统计学意义，说明ＣＡＳ９能使Ｈ２ＡＸ磷酸化水平增高。??ｋ?ＤＡＰＩ?ｙＨ２ＡＸ?ＣＡＳ９?Ｍｅｒｇｅ?Ｂ??■■Ｉ！！，??■■Ｉｋ??图１－４：免疫荧光实验显示Ｈ９中，Ｔｅｔ－ＣＡＳ９诱导ＹＨ２ＡＸ水平增高。Ａ为免疫荧光结果??图，Ｂ为重复三次试验后的统计图（＊Ｐ＜０．０５广Ｐ＜０．０１广＊Ｐ０．００１）??Ｆｉｇｕｒｅ?１－４：Ｉｎ?Ｈ９，ｔｈｅ?ｎｕｍｂｅｒｓ?ｏｆ?ｙＨ２ＡＸ?ｆｏｃｉ?ｉｎｃｒｅａｓｅｄ?ｂｙ?ｔｈｅ?ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｔｅｔ－ＣＡＳ９．Ａ?ｉｓ?ｔｈｅ??ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｒｅｓｕｌｔｓ，?Ｂ?ｉｓ?ｔｈｅ?ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ａｆｔｅｒ?ｒｅｐｅａｔｉｎｇ?ｔｈｅ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ?ｔｈｒｅｅ??ｔｉｍｅｓ（＊?Ｐ＜０．０５，?＊?＊Ｐ＜０．０１?，＊?＊?＊?Ｐ＜０．００１）??３．５彗星实验检测Ｈ９中过表达ＣＡＳ９后ＤＮＡ的损伤情况??彗星实验可以在单细胞水平上检测ＤＮＡ损伤的发生，损伤程度越重，彗尾??越长。阿霉素（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｎｃｉｎ，Ｄｏｘ）又名多柔比星，在临床上用于肿瘤的化??疗，它可以嵌入ＤＮＡ碱基对之间，弓｜起细胞ＤＮＡ的损伤。我们通过彗星实验探??宄ＣＡＳ９对ＤＮＡ损伤的影响，将
本文编号：3229705
【文章来源】：南方医科大学广东省
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１：?Ｈ９中，Ｔｅｔ－ＣＡＳ９在Ｄｏｘｙ处理后２４ｈ、４８ｈ均可以诱导ＤＮＡ损伤通路相关蛋白的??表达
ｙ?ｉｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ??ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ??３．３?ＣＡＳ９能激活ｐ５３信号通路??我们利用Ｑｐｃｒ对ｐ５３凋亡通路的下游靶基因的ｍＲＮＡ水平进行检测，结果发??现ＮＯＸＡ、ｐ２１、ＰＥＲＰ及ＰＵＭＡ水平均明显升高。说明ＣＡＳ９单独的过表达能激??活ｐ５３彳Ｓ号通路。??Ｃ??．２?１５，??％??Ｉ．?？ＣＴＬ??ｓ?＂ＣＡＳ９?ｒ??ａ：??ｅ?ｈ?＊??．１５＇?Ｉ?１?＊＊??＾?ｏＷｉ?ｍ???ＮＯＸＡ?ｐ２１?ＰＥＲＰ?ＰＵＭＡ??图１－３：?ｐ５３凋亡通路下游靶基因ＮＯＸＡ、ｐ２１、ＰＥＲＰ及ＰＵＭＡ的ｍＲＮＡ水平均明显升尚??２１??
ｎｃｒｅａｓｅｄ．??３．４免疫荧光实验检测Ｈ９中过表达ＣＡＳ９对丫?Ｈ２ＡＸ焦点数量的影响??当ＤＮＡ双链断裂损伤发生时，Ｈ２ＡＸ会被迅速磷酸化，并在荧光显微下形??成一个一个的焦点，是检测ＤＳＢ的重要标志物。我们通过免疫荧光实验看到，??与不加Ｄｏｘｙ的对照组相比，Ｄｏｘｙ处理的Ｈ９细胞中ＹＨ２ＡＸ焦点的数量显著增??多，并且具有统计学意义，说明ＣＡＳ９能使Ｈ２ＡＸ磷酸化水平增高。??ｋ?ＤＡＰＩ?ｙＨ２ＡＸ?ＣＡＳ９?Ｍｅｒｇｅ?Ｂ??■■Ｉ！！，??■■Ｉｋ??图１－４：免疫荧光实验显示Ｈ９中，Ｔｅｔ－ＣＡＳ９诱导ＹＨ２ＡＸ水平增高。Ａ为免疫荧光结果??图，Ｂ为重复三次试验后的统计图（＊Ｐ＜０．０５广Ｐ＜０．０１广＊Ｐ０．００１）??Ｆｉｇｕｒｅ?１－４：Ｉｎ?Ｈ９，ｔｈｅ?ｎｕｍｂｅｒｓ?ｏｆ?ｙＨ２ＡＸ?ｆｏｃｉ?ｉｎｃｒｅａｓｅｄ?ｂｙ?ｔｈｅ?ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｔｅｔ－ＣＡＳ９．Ａ?ｉｓ?ｔｈｅ??ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｒｅｓｕｌｔｓ，?Ｂ?ｉｓ?ｔｈｅ?ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ａｆｔｅｒ?ｒｅｐｅａｔｉｎｇ?ｔｈｅ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ?ｔｈｒｅｅ??ｔｉｍｅｓ（＊?Ｐ＜０．０５，?＊?＊Ｐ＜０．０１?，＊?＊?＊?Ｐ＜０．００１）??３．５彗星实验检测Ｈ９中过表达ＣＡＳ９后ＤＮＡ的损伤情况??彗星实验可以在单细胞水平上检测ＤＮＡ损伤的发生，损伤程度越重，彗尾??越长。阿霉素（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｎｃｉｎ，Ｄｏｘ）又名多柔比星，在临床上用于肿瘤的化??疗，它可以嵌入ＤＮＡ碱基对之间，弓｜起细胞ＤＮＡ的损伤。我们通过彗星实验探??宄ＣＡＳ９对ＤＮＡ损伤的影响，将
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