钙调蛋白磷酸酶调节蛋白对钙调蛋白磷酸酶的调节机制研究
发布时间：2021-06-19 13:53
钙调蛋白磷酸酶（calcineurin,CN）是丝苏氨酸蛋白磷酸酶家族中唯一一个受钙离子和钙调素调控的蛋白磷酸酶,在钙信号传递中起着十分重要的作用。CN在人体各个器官都有表达,参与免疫应答、细胞凋亡、骨成型、肌肉发育、心血管生成和学习记忆等多种生物学进程。临床上CN作为免疫抑制作用靶点,开发出特异性更高的CN抑制剂将为广大患者带来福音。钙调蛋白磷酸酶调节蛋白1（Regulator of calcineurin 1,RCAN1）是CN的内源性抑制蛋白,负反馈调节CN的磷酸酶活力,因此研究RCAN1对CN的调控机制将为药物开发提供新思路。本文通过结构生物学和酶动力学相结合的方法,对RCAN1抑制CN的磷酸酶活力进行研究。首先,我们运用分子克隆、蛋白纯化相关实验技术,获得了高浓度、高纯度的重组CN蛋白,RCAN1-4蛋白,RCAN1-4 C端58个氨基酸组成的蛋白片段（由RCAN1-4外显子7编码,故简写为RCAN1-4 ex7）。我们运用酶动力学方法监测了 RCAN1-4对CN的抑制,发现RCAN1-4以及C端ex7片段即使在饱和浓度下也不能完全抑制CN的磷酸酶活力;RCAN1-4与CN相...
【文章来源】：苏州大学江苏省
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－２：?ＮＦＡＴ家族蛋白成员⑷??在免疫细胞中，ＣＮ－ＮＦＡＴ信号通路促进细胞因子（几－２，亿－３，１１＾４，１１＾??
第１章?妈调蛋白磷酸酶调节蛋白对钙调蛋ｆｌ憐酸酶的调节机制研究??减弱［ｕ］。??１．２．３?钙调蛋白磷酸酶的结构??钙调蛋白磷酸酶的ＣＮＡ亚基分子量约６０?ＫＤ，从Ｎ端到Ｃ端依次是催化结??构域（Ｃａｔａｌｙｔｉｃｄｏｍｉａｎ，ＣＤ），Ｂ?亚基结合螺旋（Ｂｓｕｂｕｎｉｔｂｉｎｄｉｎｇｈｅｌｉｘ，ＢＢＨ），??ＣａＭ?结合结构域（ＣａＭ?ｂｉｎｄｉｎｇ?ｄｏｍａｉｎ，ＣＢＤ），自抑制结构域（Ａｕｔｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｒｙ??ｄｏｍｉａｎ，ＡＩＤ），后三部分称为?Ａ?亚基调节区（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ?ｒｅｇｉｏｎ，?ＲＤ）。??１９９５年Ｇｒｉｆｆｉｔｈ?ＪＰ等人解析了第一个ＣＮ蛋白结构：ＣＮ－ＦＫ５０６－ＦＫＢＰ１２复??合物结构，但此结构并不可见ＡＩＤ，?ＣＢＤ结构。在随后解析的ＣＮ结构中可ＡＩＤ??结构，但一直没有解析出完整的ＣＢＤ结构。２０１６年Ｌｉ?ＳＪ等人解析的人源ＣＮｐ??结构，才可见一小段ＣＢＤ结构，其结合在ＣＮＡ和ＣＮＢ亚基相互作用界面处??（图?１－３）。??１?ｉ?＾．ｒ＇，ｕ；＂ＴＢ?Ｓ?ＨＦＥｉｒ?ＣＮＡ?Ａ??１?ｒｗ．ｒ，－，－ｒｓｉ［＾ｌｉ?ＣＮＢ?「」＾??图１－３：人源ＣＮ０结构示意图??红色区域为催化结构域ＣＤ，蓝色为ＢＢＨ，灰色为ＣＢＤ，蓝绿色为ＡＩＤ，??绿色为ＣＮＢ亚基（ＰＤＢＩＤ：?４０Ｒ９）??ＣＮ的催化结构域形状接近于椭圆体，约３５０个氨基酸残基。由两个ｐ－ｓｈｅｅｔ??形成非典型的Ｐ三明治结构，它的一侧是ａ－ｈｅｌｉｘ／ｐ－ｓｔｒａｎｄ混合结构，另一侧全部??４??
钙调蛋白磷酸酶调节蛋白对钙调蛋白磷酸酶的调节机制研宄?第１章??是ｃｃ－ｈｅｌｉｘ。催化核心存在一个铁离子（Ｆｅ３＋）和一个锌离子（Ｚｎ２＋），形成金属离??子催化中心（图１－３，?Ａ）。ＢＢＨ形成一段ａ螺旋，在全酶结构中被ＣＮＢ亚基形??成的疏水口袋包埋。ＣＢＤ完整结构在所有的ＣＮ结构中不可见，但是在２００８年??Ｙｅ?Ｑ等人解析的ＣＢＤ片段与ＣａＭ复合物结构中，ＣＢＤ形成ａ螺旋与ＣａＭ结??合％随后２０１４年Ｌｉ?ＳＪ等人解析人源ＣＮｐ蛋白，发现在ＣＢＤ中还存在一段??自抑制基序（Ａｕｔｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ?ｓｅｇｍｅｎｔ，ＡＩＳ），ＡＩＳ结合在底物锚定位点，阻止底??物锚定ＣＮ［１３］。Ｃ端的ＡＩＤ形成一段ａ－ｈｅｌｉｘ，结合在催化活性中心，阻止底物进??入活性中心（图１－４）。??ａ??ＣＮ?ａ?ｉｎ?ｃｏｍｐｌｅｘ?ｗｉｔｈ?Ａ２３８Ｌ??谓??ｂ?ＣＮ?ｐ??＇?＂；；＼＾＾＾ｉ｝ｕＡ２２??？ｆ＇?ｊｉ??图１－４：?ＡＩＳ同ＣＮ相互作用模式??Ａ：?ＣＮａ与Ａ２３８ＬＬｘＶＰｍｏｔｉｆ结合示意图；Ｂ：?ＣＮＰ与ＡＩＳ结合示意图??［Ｉ３１。ＡＩＳ?占据了?Ａ２３８Ｌ?Ｌｘ?ＶＰ?ｍｏｔｉｆ?锚定位置??钙调蛋白磷酸酶的ＣＮＢ亚基形状类似两个球体，分为Ｎ－ｌｏｂｅ和Ｃ－ｌｏｂｅ。每??个ｌｏｂｅ含有两个ＥＦ－ｈａｎｄ，每个ＥＦ－ｈａｎｄ可结合一个Ｃａ２＋，Ｎ－ｌｏｂｅ的ＥＦ－１和ＥＦ－??２与Ｃａ２＋结合能力较低，结合常数在微摩尔级别。Ｃ－Ｌｏｂｅ的ＥＦ３和ＥＦ４与Ｃａ２＋??结合能力较强，结合常数在纳摩尔级别。通常情况下，ＥＦ３和ＥＦ４紧紧结合两个??５??
本文编号：3237935
【文章来源】：苏州大学江苏省
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－２：?ＮＦＡＴ家族蛋白成员⑷??在免疫细胞中，ＣＮ－ＮＦＡＴ信号通路促进细胞因子（几－２，亿－３，１１＾４，１１＾??
第１章?妈调蛋白磷酸酶调节蛋白对钙调蛋ｆｌ憐酸酶的调节机制研究??减弱［ｕ］。??１．２．３?钙调蛋白磷酸酶的结构??钙调蛋白磷酸酶的ＣＮＡ亚基分子量约６０?ＫＤ，从Ｎ端到Ｃ端依次是催化结??构域（Ｃａｔａｌｙｔｉｃｄｏｍｉａｎ，ＣＤ），Ｂ?亚基结合螺旋（Ｂｓｕｂｕｎｉｔｂｉｎｄｉｎｇｈｅｌｉｘ，ＢＢＨ），??ＣａＭ?结合结构域（ＣａＭ?ｂｉｎｄｉｎｇ?ｄｏｍａｉｎ，ＣＢＤ），自抑制结构域（Ａｕｔｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｒｙ??ｄｏｍｉａｎ，ＡＩＤ），后三部分称为?Ａ?亚基调节区（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ?ｒｅｇｉｏｎ，?ＲＤ）。??１９９５年Ｇｒｉｆｆｉｔｈ?ＪＰ等人解析了第一个ＣＮ蛋白结构：ＣＮ－ＦＫ５０６－ＦＫＢＰ１２复??合物结构，但此结构并不可见ＡＩＤ，?ＣＢＤ结构。在随后解析的ＣＮ结构中可ＡＩＤ??结构，但一直没有解析出完整的ＣＢＤ结构。２０１６年Ｌｉ?ＳＪ等人解析的人源ＣＮｐ??结构，才可见一小段ＣＢＤ结构，其结合在ＣＮＡ和ＣＮＢ亚基相互作用界面处??（图?１－３）。??１?ｉ?＾．ｒ＇，ｕ；＂ＴＢ?Ｓ?ＨＦＥｉｒ?ＣＮＡ?Ａ??１?ｒｗ．ｒ，－，－ｒｓｉ［＾ｌｉ?ＣＮＢ?「」＾??图１－３：人源ＣＮ０结构示意图??红色区域为催化结构域ＣＤ，蓝色为ＢＢＨ，灰色为ＣＢＤ，蓝绿色为ＡＩＤ，??绿色为ＣＮＢ亚基（ＰＤＢＩＤ：?４０Ｒ９）??ＣＮ的催化结构域形状接近于椭圆体，约３５０个氨基酸残基。由两个ｐ－ｓｈｅｅｔ??形成非典型的Ｐ三明治结构，它的一侧是ａ－ｈｅｌｉｘ／ｐ－ｓｔｒａｎｄ混合结构，另一侧全部??４??
钙调蛋白磷酸酶调节蛋白对钙调蛋白磷酸酶的调节机制研宄?第１章??是ｃｃ－ｈｅｌｉｘ。催化核心存在一个铁离子（Ｆｅ３＋）和一个锌离子（Ｚｎ２＋），形成金属离??子催化中心（图１－３，?Ａ）。ＢＢＨ形成一段ａ螺旋，在全酶结构中被ＣＮＢ亚基形??成的疏水口袋包埋。ＣＢＤ完整结构在所有的ＣＮ结构中不可见，但是在２００８年??Ｙｅ?Ｑ等人解析的ＣＢＤ片段与ＣａＭ复合物结构中，ＣＢＤ形成ａ螺旋与ＣａＭ结??合％随后２０１４年Ｌｉ?ＳＪ等人解析人源ＣＮｐ蛋白，发现在ＣＢＤ中还存在一段??自抑制基序（Ａｕｔｏｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ?ｓｅｇｍｅｎｔ，ＡＩＳ），ＡＩＳ结合在底物锚定位点，阻止底??物锚定ＣＮ［１３］。Ｃ端的ＡＩＤ形成一段ａ－ｈｅｌｉｘ，结合在催化活性中心，阻止底物进??入活性中心（图１－４）。??ａ??ＣＮ?ａ?ｉｎ?ｃｏｍｐｌｅｘ?ｗｉｔｈ?Ａ２３８Ｌ??谓??ｂ?ＣＮ?ｐ??＇?＂；；＼＾＾＾ｉ｝ｕＡ２２??？ｆ＇?ｊｉ??图１－４：?ＡＩＳ同ＣＮ相互作用模式??Ａ：?ＣＮａ与Ａ２３８ＬＬｘＶＰｍｏｔｉｆ结合示意图；Ｂ：?ＣＮＰ与ＡＩＳ结合示意图??［Ｉ３１。ＡＩＳ?占据了?Ａ２３８Ｌ?Ｌｘ?ＶＰ?ｍｏｔｉｆ?锚定位置??钙调蛋白磷酸酶的ＣＮＢ亚基形状类似两个球体，分为Ｎ－ｌｏｂｅ和Ｃ－ｌｏｂｅ。每??个ｌｏｂｅ含有两个ＥＦ－ｈａｎｄ，每个ＥＦ－ｈａｎｄ可结合一个Ｃａ２＋，Ｎ－ｌｏｂｅ的ＥＦ－１和ＥＦ－??２与Ｃａ２＋结合能力较低，结合常数在微摩尔级别。Ｃ－Ｌｏｂｅ的ＥＦ３和ＥＦ４与Ｃａ２＋??结合能力较强，结合常数在纳摩尔级别。通常情况下，ＥＦ３和ＥＦ４紧紧结合两个??５??
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