酪氨酸羟化酶的大肠杆菌表达载体构建

发布时间：2021-06-20 12:51

　　酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）的作用是将L-酪氨酸催化为L-多巴,而L-多巴是多巴胺的前体物质。TH功能异常导致多巴胺合成受损,进而引起多种神经性疾病的发生。为了探索TH的结构和功能性质,文章利用基因工程技术和生物学方法,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增TH基因全长,连接至pET-28a载体,构建原核表达载体pET-28a/TH,转入表达菌株E.coli BL21,IPTG诱导表达蛋白。结果表明,pET-28a/TH表达载体构建成功,并且TH基因能有效表达,为进一步研究该基因的分子机制奠定了基础。 

【文章来源】：合肥工业大学学报(自然科学版). 2020,43(10)北大核心

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

PCR扩增目的片段

用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ切割目的基因和pET-28a载体,酶切后进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图2所示,图2中,M为DNA Marker;1为TH基因PCR产物;2为载体酶切产物。由图2可知,目的基因和载体均已发生双酶切并获得酶切产物,酶切后的基因和载体条带清晰、大小正确,证明重组表达质粒构建成功,可用于下一步实验。将酶切过的基因和载体用T4 DNA连接酶于16 ℃金属浴中过夜连接,然后将重组质粒转入克隆载体E.coli DH5a,用含有100 mg/mL氨苄青霉素的LB平板筛选阳性单克隆,结果如图3所示。由图3可知,根据大肠杆菌在琼脂培养基上的菌落形态为圆形、边缘整齐、表面光滑、半透明、小凸起。由此可以判断平板上生长的是大肠杆菌,且未被杂菌污染。

将酶切过的基因和载体用T4 DNA连接酶于16 ℃金属浴中过夜连接,然后将重组质粒转入克隆载体E.coli DH5a,用含有100 mg/mL氨苄青霉素的LB平板筛选阳性单克隆,结果如图3所示。由图3可知,根据大肠杆菌在琼脂培养基上的菌落形态为圆形、边缘整齐、表面光滑、半透明、小凸起。由此可以判断平板上生长的是大肠杆菌,且未被杂菌污染。挑取单克隆进行菌落PCR鉴定并电泳检测,TH过表达菌株的菌落的PCR鉴定结果如图4所示,图4中,M为DNA Marker;1～16为单菌落克隆(TH基因PCR产物)。由图4可知,挑选的大部分单菌落都是阳性菌落,扩增后条带大小也正确。

【参考文献】：
期刊论文
[1]酪氨酸羟化酶与神经性疾病[J]. 贾艺舒,金文杰,宋巧娟,奚耕思.  中国组织化学与细胞化学杂志. 2016(01)
[2]关于中国人口老龄化的过程预测[J]. 任大伟.  现代商业. 2015(02)



本文编号：3239229