数字PCR技术的发展及应用
发布时间：2021-07-17 09:55
数字PCR（Digital PCR, dPCR）是继实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR, qPCR）之后发展的高灵敏核酸绝对定量分析技术,通过把反应体系均分到大量独立的微反应单元中进行PCR扩增,并根据泊松分布和阳性比例来计算核酸拷贝数实现定量分析。与传统PCR技术相比,数字PCR技术不依赖于标准曲线,具有更高灵敏度、准确度及高耐受性,可实现对样品的绝对定量分析。近年来,随着微流控技术日臻成熟,基于微流控技术的数字PCR技术得到了快速的发展,在基因突变检测、拷贝数变异检测、病毒微生物检测、转基因食品检测以及测序等方面均得到广泛的应用。本文对数字PCR的原理、技术发展和应用进行了概述。
【文章来源】：化学进展. 2020,32(05)北大核心SCICSCD
【文章页数】：13 页
【部分图文】：
(a)基于毛细管的集成液滴数字PCR系统[43];(b)基于喷墨打印技术的在线检测的数字PCR系统[44]
Li等[46]发展了一种基于微孔阵列的乳化方法,可在PDMS微孔阵列中快速地产生单分散琼脂糖液滴,并将其应用于数字PCR的绝对定量分析(图13b)。基于琼脂糖液滴的溶胶-凝胶转换特性使得能够通过在-20 ℃下冷却液滴阵列来形成稳定的微珠,可保持每个液滴的单克隆性并对所需液滴进行选择性回收。利用DNA测序和流式细胞分选方法证明了液滴的单克隆性,显示了该方法对单分子扩增分析所具有的稳定性和灵活性。Shen等[47, 48]提出了一种基于滑动芯片的数字PCR系统,可对核酸进行绝对定量分析。滑动芯片主要由两块紧密接触的分别加工有微结构的上下两片玻璃平板组成,通过上下平板之间的滑动完成PCR反应液的引入与间隔,可形成1280个独立的2.6 nL的液滴,如图14a所示。该系统被应用于定量检测金黄葡萄球菌基因组DNA样品。此外,基于滑动芯片还发展了多体积数字PCR系统[49],显著地提高了动态检测范围(图14b)。将该多体积数字PCR方法用于对人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)和丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)的病毒载量进行定量分析,可实现1.8×103～1.2×107 copies/mL的浓度检测范围,其结果与常规方法检测得到的结果一致[50]。
数字PCR(Digital PCR, dPCR)是20世纪90年代末发展起来的一种核酸分子绝对定量技术[5, 6]。该技术可理解为在大规模平行微反应器内进行单分子水平的荧光PCR扩增与计数式检测,相较于qPCR技术,能够直接计数DNA分子的个数,可实现样品的绝对定量分析。数字PCR过程主要包括样品的分散、PCR扩增以及荧光信号的采集与数据分析。该技术在有限稀释模式下,使样品模板随机分散到数百个至数百万个的独立反应单元中,每个反应单元中可能包含有零个、一个或多个DNA模板分子,模板分子的分散符合泊松分布。PCR扩增结束后有荧光信号单元记为1,无荧光信号则记为0,即根据荧光信号的有和无将反应单元分别定义为阳性和阴性。通过对反应单元总数和阳性反应单元数目进行统计,根据泊松分布公式即可计算出DNA模板分子的起始浓度,原理如图1所示[7, 8]。理想情况下,当待测样品的DNA浓度被稀释到很低水平时,样品溶液被分散到大量的反应单元中,使每个反应单元所含有的DNA分子数最多只有一个,这种条件下,可通过对阳性反应单元的数目进行统计,直接确定DNA模板分子的起始数目。但当测定高浓度模板时,部分反应单元中含有两个或两个以上DNA分子,大量DNA模板分子的随机分布情况符合泊松分布。因此,DNA模板分子的绝对浓度可以采用泊松分布概率公式计算[9]。
【参考文献】：
期刊论文
[1]数字PCR技术进展[J]. 林彩琴,姚波. 化学进展. 2012(12)
本文编号：3287946
【文章来源】：化学进展. 2020,32(05)北大核心SCICSCD
【文章页数】：13 页
【部分图文】：
(a)基于毛细管的集成液滴数字PCR系统[43];(b)基于喷墨打印技术的在线检测的数字PCR系统[44]
Li等[46]发展了一种基于微孔阵列的乳化方法,可在PDMS微孔阵列中快速地产生单分散琼脂糖液滴,并将其应用于数字PCR的绝对定量分析(图13b)。基于琼脂糖液滴的溶胶-凝胶转换特性使得能够通过在-20 ℃下冷却液滴阵列来形成稳定的微珠,可保持每个液滴的单克隆性并对所需液滴进行选择性回收。利用DNA测序和流式细胞分选方法证明了液滴的单克隆性,显示了该方法对单分子扩增分析所具有的稳定性和灵活性。Shen等[47, 48]提出了一种基于滑动芯片的数字PCR系统,可对核酸进行绝对定量分析。滑动芯片主要由两块紧密接触的分别加工有微结构的上下两片玻璃平板组成,通过上下平板之间的滑动完成PCR反应液的引入与间隔,可形成1280个独立的2.6 nL的液滴,如图14a所示。该系统被应用于定量检测金黄葡萄球菌基因组DNA样品。此外,基于滑动芯片还发展了多体积数字PCR系统[49],显著地提高了动态检测范围(图14b)。将该多体积数字PCR方法用于对人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)和丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)的病毒载量进行定量分析,可实现1.8×103～1.2×107 copies/mL的浓度检测范围,其结果与常规方法检测得到的结果一致[50]。
数字PCR(Digital PCR, dPCR)是20世纪90年代末发展起来的一种核酸分子绝对定量技术[5, 6]。该技术可理解为在大规模平行微反应器内进行单分子水平的荧光PCR扩增与计数式检测,相较于qPCR技术,能够直接计数DNA分子的个数,可实现样品的绝对定量分析。数字PCR过程主要包括样品的分散、PCR扩增以及荧光信号的采集与数据分析。该技术在有限稀释模式下,使样品模板随机分散到数百个至数百万个的独立反应单元中,每个反应单元中可能包含有零个、一个或多个DNA模板分子,模板分子的分散符合泊松分布。PCR扩增结束后有荧光信号单元记为1,无荧光信号则记为0,即根据荧光信号的有和无将反应单元分别定义为阳性和阴性。通过对反应单元总数和阳性反应单元数目进行统计,根据泊松分布公式即可计算出DNA模板分子的起始浓度,原理如图1所示[7, 8]。理想情况下,当待测样品的DNA浓度被稀释到很低水平时,样品溶液被分散到大量的反应单元中,使每个反应单元所含有的DNA分子数最多只有一个,这种条件下,可通过对阳性反应单元的数目进行统计,直接确定DNA模板分子的起始数目。但当测定高浓度模板时,部分反应单元中含有两个或两个以上DNA分子,大量DNA模板分子的随机分布情况符合泊松分布。因此,DNA模板分子的绝对浓度可以采用泊松分布概率公式计算[9]。
【参考文献】：
期刊论文
[1]数字PCR技术进展[J]. 林彩琴,姚波. 化学进展. 2012(12)
本文编号：3287946
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/3287946.html
