LINE-1 DNA甲基化：鉴别同卵双生个体的潜在遗传标记

发布时间：2017-12-07 06:11

  本文关键词：LINE-1 DNA甲基化：鉴别同卵双生个体的潜在遗传标记

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【摘要】：目的：由于同卵双生子（monozygotictwins，MZ）是由一个受精卵分裂成两个胚胎进而发育成的两个个体，他们具有完全相同或极其相似的基因组DNA序列，应用现有的DNA遗传标记无法有效区分MZ的两个个体，导致一些与MZ有关的案件无法侦破。因此，，如何从遗传学角度准确认定MZ的两个个体，是法医学DNA分析领域亟待解决的难题。5-甲基胞嘧啶（5-methylcystein，5mC）即在胞嘧啶的第5位碳原子上添加一个甲基，被称作第6种碱基，是一种重要的表观遗传现象。近来研究发现MZ个体之间5mC存在差异。本课题组前期研究检测了1对新生儿MZ的全基因组甲基化谱，发现有2205条存在DNA甲基化差异的序列，这些差异序列大部分分布在重复序列，尤以散在重复序列为著，如短散布元件Alu序列和长散布元件（longinterspersedelements,LINE-1）。LINE-1在人类基因组的拷贝数大于50万，占人类基因组的17%，因此其甲基化程度可代表核基因组的甲基化程度。本研究拟对LINE-1序列的DNA甲基化水平进行大样本双生子调查，以评估其鉴别MZ的能力以及潜在的应用价值。 方法：按照知情同意原则，收集了176对双生子血液样本及漱口水样本。应用QIAampDNABloodkit提取血液样本的全基因组DNA，应用漱口水提取试剂盒提取漱口水的全基因组DNA。用GoldeneyeDNA身份鉴定系统BASIC试剂盒检测DNA样本的19个常染色体短串联重复序列（shorttandemrepeat,STR）基因座分型，以确定每对双生子样本的同异卵情况。应用EZDNAMethylation-GoldKit对基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化，以转化的DNA为模板，扩增LINE-1靶序列。对扩增产物进行单链纯化后，用PyroMarkGoldQ96Reagents和PyroMarkID焦磷酸测序仪进行焦磷酸测序反应，每个样本重复三次，获得LINE-1序列3个CpG位点甲基化程度的定量数据。应用主成份分析、Spearman相关检验、配对t检验、方差分析、秩和检验等方法进行统计学分析。 结果： 1样本概况 经STR分型鉴定，176对血液样本包含119对MZ和57对DZ，64对漱口水样本包含50对MZ及14对DZ。 2LINE-1靶序列DNA甲基化水平及位点间的相关性分析 在所调查的352个血液样本中，3个CpG位点甲基化平均值分别为81.26%、73.91%、74.74%；在128个漱口水样本中，分别为73.18%、69.86%、67.85%，明显低于血液样本。配对t检验结果也证实，3个CpG位点甲基化在同一个体血液与漱口水样本中存在显著差异，漱口水样本中的甲基化程度显著低于血液中的甲基化程度。此外，相关系数矩阵分析显示3个CpG位点甲基化具有一定的相关性。 3MZ、DZ个体间LINE-1DNA甲基化水平差异分析 每对MZ或DZ两个个体之间甲基化水平进行配对t检验，结果显示其中15对MZ及10对DZ两个个体之间甲基化水平具有显著差异，分别占MZ及DZ总样本量的12.61%及17.54%，表明本研究选取的3个CpG位点甲基化能够鉴别12.61%的MZ和17.54%的DZ，即其鉴别DZ的能力略高于MZ。通过对MZ及DZ两个个体间甲基化差异与年龄进行相关性分析，发现无论MZ还是DZ，其差异均与年龄无明显相关性。比较MZ之间与DZ之间甲基化差值的差异程度，发现二者无显著差异。 4年龄和性别对LINE-1DNA甲基化的影响 提供血液样本的志愿者包括176对双生子，年龄0～74岁。我们按照10岁的年龄段将样本分为5个年龄组：0-10岁、11-20岁、21-30岁、31-40岁、41-50岁及50岁。通过主成分分析，分别应用PC1及CpGmean（焦磷酸测序仪测出的3个CpG位点甲基化水平的平均值）与年龄及性别进行相关性分析，结果显示：在血液样本中，年龄与PC1及CpGmean值均没有明显的相关性，秩和检验结果也表明各年龄组间的PC1值及CpGmean值均无统计学差异。但在漱口水样本中，PC1及CpGmean值与年龄均呈正相关，相关系数分别为0.382和0.378；各年龄组间的PC1值及CpGmean值也具有显著性差异。 样本的性别组成：血液样本包括168名男性及184名女性，漱口水样本包括44名男性及84名女性。在漱口水样本，男性与女性之间的PC1值及CpGmean值无显著性差异，而在血液样本，女性样本的CpGmean及PC1的平均值略低于男性样本，具有统计学意义。 5不同民族和居住地对LINE-1DNA甲基化的影响 样本志愿者来自三个民族：汉族、哈尼族及彝族，汉族志愿者主要来自河北和山西，少数来自云南，哈尼族和彝族志愿者均来自云南。相关分析及秩和检验均表明来自不同民族、不同居住地的样本的LINE-1DNA甲基化程度均无显著差异，表明民族和居住地对其无影响。 6职业和教育程度对LINE-1DNA甲基化的影响 为评价不同职业对LINE-1DNA甲基化是否有影响，将样本分为脑力劳动组（88个血液样本、37个漱口水样本）、体力劳动组（31个血液样本、10个漱口水样本）、未成年人组（68个血液样本、30个漱口水样本）及其他（21个血液样本、11个漱口水样本）。相关分析及秩和检验结果表明，无论在血液样本还是漱口水样本，不同职业的PC1及CpGmean的平均值均具有显著差异。 为进一步探讨教育程度是否也是LINE-1DNA甲基化的影响因素，将样本分为四种教育程度：硕士及以上程度（5个血液样本、0个漱口水样本）、大学程度（16个血液样本、7个漱口水样本）、中学程度（16个血液样本、10个漱口水样本）、小学程度（136个血液样本、73个漱口水样本）。血液样本PC1值及CpGmean与教育程度均具有相关性，相关系数分别为0.162及0.161。秩和检验也证实，PC1值及CpGmean在不同教育水平之间的差别具有统计学意义。 7吸烟对LINE-1DNA甲基化的影响 无论血液样本还是漱口水样本，吸烟组与不吸烟组的LINE-1DNA甲基化PC1值及CpGmean的平均值均无显著差异。 结论：本研究应用焦磷酸测序技术对LINE-1序列中的3个CpG位点DNA甲基化进行定量分析，可鉴别MZ个体，鉴别能力为12.61%。虽然鉴别能力不高，但为解决法医学MZ识别难题提供了初步可行的解决方案，后续研究将增加检测的位点，提高检测系统的累积鉴别能力，具有一定的应用前景。由于LINE-1DNA甲基化具有组织差异性及年龄相关性，在实际应用中必须考虑样本组织类型及年龄的影响。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：D919.1

【参考文献】

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6 徐酩;吕京o

本文编号：1261408