土壤细菌16S rRNA基因V3区种属特异性检测的法医学应用研究

发布时间：2018-02-19 21:26

  本文关键词： 法医学 变性梯度凝胶电泳(DGGE) 基因组DNA 16S rRNA 微生物多样性　出处：《中国医科大学》2008年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 前言 人类以各种形式研究土壤并将其应用于案件调查已有上千年的历史。在法医学领域,土壤被作为和案发现场有关的可疑物证,以前主要是基于地质学特征加以区别。但案件中所涉及的土壤样品大多微量,制约了土壤这一重要物证在法医学上的广泛应用。随着分子生物学技术的快速发展,拓展了人们对土壤微生物的认识,对土壤微生物群体DNA多样性研究日益增多。 微生物是一群体形微小、结构简单、低等生物的总称,与其他环境相比土壤中的微生物数量最大,种类也最多。生活在土壤中的微生物由于营养和生态位点的竞争、相互影响和制约,形成了一个动态平衡的土壤微生物群落。土壤微生物不仅是土壤中物质循环的驱动力,其代谢物也是植物的营养成分,其活动能直接影响到土壤的物理、化学性质。不同地点土壤样品间的微生物群体,由于土壤成分及周围环境差异,其种类和数量呈现出明显的多样性。因此对微量土壤检材进行微生物检测,有着重要的法医学应用前景。 目前在生态学和环境科学的研究领域,关于土壤微生物尤其是土壤中微生物多样性的研究越来越受到重视。大量的实验研究表明,在蛋白质、DNA和RNA等可被看作是分子计时器的生物大分子中,最适合于揭示各类生物亲缘关系的是rRNA,尤其是16S rRNA。核糖体16S rRNA(16S rRNA)基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列,它集保守性与变异性于一身,是目前应用最广的分子微生物学检测的靶基因。目前,国内法医学领域尚无关于土壤细菌16S rRNA基因方面的相关研究。本研究拟采用变性梯度凝胶电泳技术以土壤微生物群体的基因组DNA为研究对象,通过比较不同土壤中各种微生物的16S rRNA基因信息了解微生物的多样性,初步判断土壤样品的来源,进而为解决微量土壤物证检材检测开拓一种新的途径。 具体研究思路如下:以CTAB、溶菌酶和蛋白酶K裂解细胞,用PEG 8000沉淀和纯化DNA,直接对土壤微生物总DNA进行提取,选择特异性引物F_(357)GC和R_(518)对16S rDNA V3区进行扩增,PCR产物经变性梯度凝胶电泳(DGGE)进行分离后,得到不同数目的电泳条带。通过对电泳条带位置及数量的比较,初步判断土壤样品的来源。 材料与方法 1、随机选取两个采样点(A、B)分别取地表、距地表10cm、20cm、30cm四个深度不同量的土壤样本(300mg、200mg、100mg、80mg、60mg)。 2、采用CTAB-溶菌酶-蛋白酶K-冻融裂解法对土壤样本总DNA进行提取,用PEG8000沉淀和纯化DNA。 3、选择特异性引物F_(357)GC和R_(518)对土壤细菌16S rDNA V3区进行扩增。 4、采用紫外分光光度计与琼脂糖凝胶电泳对DNA进行质量检测。 5、采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和变性梯度凝胶电泳(DGGE)对扩增产物进行检测分析。 结果 1、采用紫外分光光度计对待检土壤样品进行检测,其OD_(260/280)均分布在1.5～1.68之间。 2、琼脂糖凝胶电泳显示,扩增产物片段长度在230bp左右,是目的片段。 3、经PCR-DGGE检测可以初步判断土壤样品的同一性。 结论 PCR-DGGE技术能够对土壤样品中不同细菌16S rDNA V3区的DNA扩增片断进行分离,初步判断土壤样品的来源。它是一种有效的微生物多样性研究技术,并可初步应用于法医学领域微量土壤检材的检测。
[Abstract]:Preface
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本文编号：1518017