多重耐药RP4质粒影响氨氧化菌硝化反应机制研究

发布时间：2018-02-23 04:18

本文关键词： RP4质粒氨氧化菌序批式反应器硝化效率基因表达　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：抗生素耐药问题严重威胁着人类的健康。水环境中的抗生素抗性基因(Antibiotic resistant genes,ARGs)种类和数量的增多,对环境和人类健康均造成了一定影响。目前ARGs已经被定义为一种新的环境污染物。污水中同样含有大量的ARGs,而污水生物处理系统不仅是抗生素进入环境的一个重要途径,同时也是耐药细菌、ARGs富集,并在环境中散播的一个重要污染源。污水处理过程中,生物脱氮有着重要的意义。这一过程先由氨氧化菌(Ammonia oxidizing bacteria,AOB)将氨氧化为亚硝酸盐,再由亚硝酸盐氧化菌(Nitrite oxidizing bacteria,NOB)将亚硝酸盐氧化为硝酸盐。ARGs作为生物大分子,有可能直接参与细菌的代谢进而影响污水生物处理系统的污染物去除效率。本研究在课题组前期针对RP4质粒水平转移影响膜生物反应器(Membrane bioreactor,MBR)和颗粒污泥生物反应器(Granular sludge bioreactor,GSBR)硝化效率的基础上进一步深入探讨RP4质粒与AOB间水平转移及其对AOB代谢影响的分子机制。研究拟构建平行运行的,以硝化反应为主体的序批式反应器(Sequencing batch reactor,SBR),按照析因设计的实验要求对不同反应器施加不同干预,观察氨氮降解,亚硝酸盐氮、硝酸盐氮生成,总混合液悬浮固体(Mixed liquor suspended solids,MLSS)及出水SS(Suspended solids)的变化情况,并通过分子生物学方法研究RP4质粒对AOB的影响机制。实验共构建了4个SBR,其中水力停留时间(Hydraulic retention time,HRT)为7.2小时。经过驯化调整后,SBR继续平稳运行约150天。正常运行过程中,氨氮在运行周期90 min内基本去除完全,亚硝酸盐氮在120 min时基本氧化完成,反应周期末硝酸盐氮增加量等于初始的氨氮含量。四个SBR平均总MLSS约1235±55.146 mg/L,平均出水SS约为24.95±0.91 mg/m L,SV30约为24%。实验同时分离纯化了一株AOB,经测序鉴定为Nitrosomonas europaea。对4个SBR施加的干预为:A反应器投加不携带质粒的大肠杆菌;B反应器投加携带RP4质粒的大肠杆菌;C反应器投加RP4质粒;D反应器作为空白对照。干预前持续记录7天数据;干预过程持续7天;干预结束后持续观察14天,全程共计28天。观察的指标有氨氮降解,亚硝酸盐氮、硝酸盐氮生成情况,总MLSS及出水SS的变化情况。实验过程中同时提取污泥样本,进行总DNA、总RNA的提取和RNA反转录的操作;并在SBR运行的第5个周期末对前一天投加供体菌进行计数。研究结果表明,仅投加携带RP4质粒的供体菌的B反应器出现了具有统计学意义的变化(P0.05)。且该反应器投加供体菌后氨氮去除率即明显降低(P0.05),停止投菌后未恢复。在实验第21天,氨氮去除率降低至70%,然后开始恢复,第25天上升至99%以上。由此可知RP4质粒的存在降低了反应器的氨氧化效率,且影响可持续一定时间。针对B反应器,亚硝酸盐氮的生成速率在第20天出现了降低,峰值浓度由约3.0mg/L降低至约1.7mg/L。同时硝酸盐氮生成减少,第20天时硝酸盐氮终浓度由约42mg/L降低至40mg/L,但单位时间内生成速率并无明显变化。可见RP4质粒的存在未影响反应器的亚硝酸盐氧化效率,亚硝酸盐氮并未出现累积。现已知的亚硝酸盐氮清除时间延长和周期末硝酸盐氮浓度降低更有可能是由于氨氧化受抑制而导致的。B反应器的出水SS出现了上升的趋势(P0.05),且出水SS最高值约达35mg/L。至第14天停止投菌后出水SS仍未恢复。直至后期第21天左右时,出水SS逐渐恢复。此后的出水SS平均水平降低至25mg/L水平。总MLSS至第28天实验结束后降低至约800 mg/L(P0.05)。研究发现投加携带RP4质粒的供体菌对SBR造成影响是由于RP4质粒与AOB接合转移造成的,单纯的供体菌和游离的RP4质粒并不能产生较大影响。研究进一步通过所获得的DNA,cDNA,结合供体菌数量变化,研究RP4质粒对AOB的影响,并对其机制进行分析。变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)结合条带测序显示反应器运行初始阶段AOB主要为Nitrosomonas和βproteobacterium菌属,均为不可培养细菌。整个实验阶段主要优势菌群并未发生明显变化;H指数在投菌前后也未发生明显改变(P0.05)。说明RP4质粒造成的氨氧化效率降低不是由于菌群结构改变造成的。持续投加供体菌时,供体菌数量稳定在105 cfu/mL。停止投菌后供体菌数量进行性下降,截止第28天,出水中仍能检测到102 cfu/mL的供体菌。荧光定量PCR测定AOB,RP4质粒和总细菌的数量变化。结果显示,在投加供体菌之前,AOB与总细菌的比值约为10-4。投加供体菌的过程中,AOB与细菌的比值依旧保持稳定。投加供体菌结束后,从第20天开始,AOB与总细菌的比值出现了一定升高(P0.05)。在投加供体菌之前,RP4质粒与总细菌的比值约为10-7。投加供体菌之后,比值迅速升高,达到10-2,并在投菌过程中基本维持在这一水平。投加供体菌结束之后,RP4与总细菌的比值出现一定的下降,但程度并不明显,至第28天时比值仍大于10-5,提示了RP4质粒与AOB等反应器内原有的微生物之间发生了接合转移。通过AOB探针、RP4探针和总细菌核酸染料DAPI进行的荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)提示了氨氧化菌和RP4质粒的共定位关系,即质粒位于氨氧化菌细胞内。说明了RP4质粒在活性污泥中发生了水平转移。同时纯培养AOB,不携带RP4质粒的大肠杆菌和未投加供体菌的活性污泥的三个对照组中并没发现荧光共定位的现象。这表明RP4质粒与包括AOB在内的污泥中微生物的接合转移,即异养菌(供体菌)向自养菌(受体菌)的接合转移,是可以在SBR正常运行过程中实现的。由cDNA通过荧光定量PCR得到的amoA基因和hao基因表达情况的数据绘制成热图(heatmap),发现仅投加携带RP4质粒的供体菌的B反应器中AOB的amoA基因和hao基因的转录有所增加。停止投菌(第14天)后,转录依然处于较高水平。至第28天时,amoA基因和hao基因的转录未明显下调。RP4质粒在AOB中发生接合转移进而上调amoA基因和hao基因的转录,这有可能是AMO等相关酶数量或(和)功能不足导致的反馈调节。综合以上结果:(1)构建了平行运行硝化反应器系统(SBR),并分离纯化出一株AOB,经鉴定为Nitrosomonas europaea。(2)研究证实了在SBR系统中,RP4质粒的水平转移可通过供体菌(异养菌)与包括AOB(自养菌)在内的活性污泥微生物发生接合转移而实现。(3)携带RP4质粒的供体菌与AOB的接合转移,是造成SBR硝化效率下降,污泥形状改变(增加出水SS)的主要原因。单纯的供体菌和RP4质粒并不能产生较大影响。(4)构建的SBR中AOB的优势菌群是Nitrosomonas和βproteobacterium。在发生RP4质粒的接合转移之后,菌群结构并未发生明显改变。说明RP4质粒造成的氨氧化效率降低不是由于菌群结构改变造成的。(5)RP4质粒在AOB中发生的接合转移可以上调amoA基因和hao基因的转录。这有可能是RP4质粒导致的AMO等相关酶数量或(和)功能不足的一种反馈调节。
[Abstract]:In this paper , we studied the effect mechanism of RP4 plasmid and AOB on the environment and human health , and the effect mechanism of RP4 plasmid on AOB was studied . The results showed that the rate of ammonia nitrogen removal decreased to about 1 . 7 mg / L at the end of the experiment . The results showed that the rate of ammonia nitrogen removal decreased to about 1 . 7 mg / L at the end of the experiment . The results showed that the nitrogen removal efficiency of the reactor was reduced to about 1 . 7 mg / L . The results showed that the ratio of AOB to total bacteria was about 10 - 4 . The results showed that the ratio of AOB to total bacteria increased after the donor bacterium was added . The results showed that the ratio of AOB to total bacteria increased after the addition of donor bacteria . ( 4 ) The dominant flora of AOB in SBR was Nitrosomonas and 尾 proteinate . After the transfer of RP4 plasmid , the structure of bacteria did not change significantly . The decrease of ammonia oxidation efficiency caused by RP4 plasmid was not caused by the change of the structure of the bacteria .

【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：X172;X703

【参考文献】