改性粘土控制有害藻华的生理生化机制研究

发布时间：2020-03-19 06:42

【摘要】：近年来,有害藻华的暴发频率逐年提高,规模不断扩大,已成为世界性的海洋灾害。目前有害藻华的众多治理方法中,改性粘土絮凝法被认为是最有效的方法之一,多次被应用于大规模有害藻华的现场治理,已经成为我国有害藻华应急处置的标准方法。在多次现场应用中,发现改性粘土对藻华生物的去除率达到80%时即可控制有害藻华,虽然水体残留的20%微藻密度依然较高,但未发现这部分微藻在短期内形成二次藻华。为了揭示残留微藻生长受抑制的机制,本文通过室内模拟实验,以典型有害甲藻强壮前沟藻(Amphidinium carterae Hulburt)和米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)为实验对象,从生理生化角度入手,考察了不同浓度改性粘土处理后,残留强壮前沟藻和米氏凯伦藻氧化应激系统和光合作用的变化;并利用实时荧光定量PCR方法,进一步研究了残留米氏凯伦藻的胁迫适应和光合作用基因表达的变化。主要成果如下:(1)改性粘土不仅可以有效絮凝沉降强壮前沟藻,而且显著地抑制该藻的生长和影响其关键生理过程。随着改性粘土浓度的增大,对强壮前沟藻的去除率增大;当改性粘土浓度≥0.10 g/L时,残留微藻的生长受到显著抑制。经过改性粘土处理后,残留微藻的丙二醛(MDA)含量上升,说明其细胞内积累了大量活性氧(ROS)。实验组残留微藻的细胞密度与超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、MDA含量均呈现出显著的负相关性,因此推测细胞内过度积累的ROS可能是抑制残留微藻生长的主要内在因素。此外,研究发现残留微藻的光合色素含量和净光合作用速率下降,表明改性粘土对残留强壮前沟藻的光合作用产生了严重伤害。叶绿素荧光动力学数据发现,单位面积上反应中心RC/CS_0显著下降,表明光合系统II(PSII)反应中心部分失去活性,引起剩余有活性的反应中心过度激发,即单位反应中心吸收的能量(ABS/RC)、捕获的能量(TR_0/RC)和用于电子传递的能量(ET_0/RC)上升。但是TR_0/ABS和ET_0/ABS下降,表明残留微藻的光能吸收和利用失去平衡。此外,0.25 g/L改性粘土处理3 h时,残留微藻W_K和V_J分别上升为对照组的1.24和1.20倍,表明其放氧复合体受到破坏,初级醌受体Q_A至次级醌受体Q_B的电子传递链受阻。改性粘土对残留微藻光合作用的以上影响,导致了叶绿体ROS的大量积累。(2)选取我国近海第二有害藻华优势种米氏凯伦藻为实验对象,开展了不同浓度改性粘土对其生长的影响研究。在实验条件下,加入0.50 g/L改性粘土,米氏凯伦藻的去除率可达到64%,并且残留微藻的生长受到了显著抑制。各实验组残留米氏凯伦藻的过氧化氢(H_2O_2)和MDA含量显著提高,表明改性粘土导致细胞内积累较多的ROS,并引起氧化压力。细胞内H_2O_2浓度与微藻细胞密度呈现显著的负相关,进一步验证了细胞内过多ROS会抑制其生长的推论。从光合作用角度,虽然残留米氏凯伦藻的实际光化学效率未受影响,即光反应能够产生足够的NADPH和电化学势,但残留微藻的最大光化学效率F_v/F_m和光合性能指数PI_(ABS)下降,表明改性粘土对其光合作用产生胁迫伤害。具体来讲,残留微藻的光能吸收和利用失衡,电子传递受阻,Q_A~-过度积累,可能导致单线氧~1O_2的产生。(3)使用实时荧光定量PCR方法,筛选了改性粘土处理条件下,米氏凯伦藻的内参基因为β-actin。定量分析了残留米氏凯伦藻的胁迫适应和光合作用相关基因表达,初步从基因水平阐释了改性粘土对残留微藻生理活动的影响。0.50 g/L改性粘土处理后,残留微藻的热休克蛋白90(HSP90)和HSP70快速参与到细胞的应激反应中,是抗逆过程的重要承担者。两者的编码基因(hsp90和dnaK)与大多数光合作用基因的表达变化呈现显著的相关性,表明两者可能参与了残留微藻光合作用的修复过程。改性粘土显著抑制了残留米氏凯伦藻光合作用的关键蛋白基因(psbC、psbB、psbA、psbD、psa B和psaA)的表达,PSII和PSI虽然受到一定程度的影响,但实际光化学效率未受影响,并经过细胞的信号传导调控,在2 d时各蛋白表达量均有不同程度的恢复。残留微藻ATP合成酶的编码基因表达量显著降低,而且保持该水平至实验后期,表明微藻对光反应提供的跨膜质子梯度利用率可能下降,合成ATP的过程受到破坏。实验组微藻核酮糖-1.5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)的大亚基编码基因rbcL表达虽然在实验前期显著下降,但在2 d时恢复至与对照无显著差别的水平,推测Rubisco蛋白含量可能不是光合作用的限制因素;根据CbbX(Rubisco活化酶)和ATP合成酶编码基因表达量的变化,推测Rubisco的活性可能降低,直接影响了CO_2固定效率,引起ROS的大量积累,从而影响其正常生长。综上所述,本文从生理生化角度研究了改性粘土对残留微藻生长的影响,为改性粘土除藻机制提供补充。结果表明,改性粘土影响残留微藻的氧化应激系统,引起细胞内过度积累ROS,形成的氧化胁迫是抑制其生长的主要内在因素。改性粘土对残留微藻的光合作用也产生较大影响,破坏光合机构,光能吸收与利用失去平衡,电子传递受阻,可能导致叶绿体ROS的形成。此外初步研究了残留微藻光合作用相关基因的表达变化,进一步从分子水平上解释了其光合生理的变化。
【图文】：

曲线,叶绿素荧光诱导动力学,曲线

叶绿素荧光诱导动力学曲线。（A）横坐标为时间；（B）横坐标为时（上图的 I 点相当于下图中的 J 点）（Govindjee，1995）.1 Atypical chlorophyll a fluorescence transient. (A) Time scale was pl; (B) Time scale was plotted on a logarithmic time scale (Govindjee，1991.A 的 O-I-D-P 曲线的时间横坐标轴进行转换成对数时间作图荧光诱导动力学曲线 O-J-I-P 相（Govindjee，1995；Strasser 1.1.B 所示。具体来讲，，在 O 点时植物叶片和藻类经过充分电子受体：初级醌受体（TheprimaryquinoneelectronacceptoThesecondaryquinoneelectronacceptor，QB）和质体醌（Plasto氧化状态，接受电子的能力最大，PSII 反应中心处于完全开复光照发射出的荧光值最小。当激发的 PSII 将电子从 P680

曲线,能量流动,中高度,器官

度的增大属于热力学阶段。饱和光 PSII 反应中心完全关闭，荧光强度曲线包含大量信息，可以反映不同李鹏民等，2005）。基础上，建立起来高度简化的衡量 1.2 所示。根据该模型，天线色素（ptionflux，ABS）后，如前文所述，式耗散掉小部分，其他主要部分被rappingflux，TR），反应中心将这部进行电子传递（Electron transport fl的数据分析方法——JIP-test，为我，已经成为该领域重要的研究工具（7）。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X52

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