白腐真菌细胞色素P450转化难降解有机物的功能研究

发布时间：2020-03-20 05:09

【摘要】： 作为普遍存在于各类生物细胞内的解毒酶,细胞色素P450与难降解有机物的生物转化密切相关。白腐真菌的模式菌种黄孢原毛平革菌是目前所知的P450基因最丰富的真菌,但目前对该真菌P450的降解功能却缺乏研究。本研究在优化黄孢原毛平革菌P450分离检测方法的基础上,分析多种难降解有机污染物对该真菌P450的诱导作用,利用P450光谱特性和微粒体P450反应特征揭示该真菌P450的降解功能,综合利用色谱、质谱、光谱手段及P450抑制剂探讨P450在该真菌总体降解过程中的作用及其与其它降解酶系的关系。黄孢原毛平革菌P450适宜的分离检测方法是:采用高速分散结合玻璃研磨破碎细胞、经差速离心分离微粒体,采用CO结合差光谱检测并严格控制通气与还原条件。正己烷、苯巴比妥、苯甲酸、氯代苯甲酸、甲苯、氯苯、2,4-二氯酚、五氯酚、菲、萘等物质对黄孢原毛平革菌P450均有明显的诱导作用,诱导后微粒体P450含量达37~137pmol/mg;P450的诱导量受营养条件、诱导剂浓度、诱导时间、培养方式等因素的影响而有明显变化。黄孢原毛平革菌P450对苯甲酸的降解活性可达29mol/(min·mol P450),胞外酶液中的锰过氧化物酶无法降解苯甲酸,抑制P450对苯甲酸降解效率没有明显影响,该真菌中存在其他苯甲酸降解酶系。该真菌P450对五氯酚的降解活性可达179mmol/(min·mol P450);在营养丰富条件下,五氯酚的降解主要依赖甲基转移酶,抑制P450会使甲基转移酶活性增强;在营养限制条件下,五氯酚的降解主要依赖甲基转移酶和锰过氧化物酶,抑制P450对五氯酚降解没有明显的影响。该真菌P450对菲的降解活性可达638mmol/(min·mol P450);在营养丰富条件下,菲的降解依赖P450参与催化的二氢二醇途径,抑制P450会明显降低菲的降解效率;在营养限制条件下,菲的降解依赖P450和锰过氧化物酶,抑制P450会明显降低菲的降解效率和菲-反-9,10-二氢二醇的生成,但不会影响锰过氧化物酶的活性。此外,抑制剂试验表明P450会参与该真菌对萘、芘、2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚的降解,并可能发挥着重要作用。
【图文】：

色谱图,黄孢原毛平革菌,微粒体,产物分析

保留时间(min)菌接种至 LN 培养基在 37℃130r/min 培养 60h 后加菲 112μmol/L，诱导 24h微粒体与菲的反应体系加菲 112μmol/L 在 37℃反应 48h；样本编号与表 6黄孢原毛平革菌微粒体 P450 降解菲的产物分析（HPLC-MS 色谱营养丰富条件下菲的降解及P450的作用研究表明黄孢原毛平革菌另一菌株 ME-446（ATCC 34541），，在降解菲的主要产物包括菲-反-9,10-二氢二醇、菲-反-3,4-二氢二D-吡喃葡萄糖苷、9-菲酚、3-菲酚、4-菲酚等，但尚未明确 P450 研究采用黄孢原毛平革菌模式菌株 BKM-F-1767，已发现菲能诱，并明确了该真菌 P450 能够降解菲；本节将分析该真菌在 PDB的产物，探讨黄孢原毛平革菌不同菌株中菲降解途径及 P450 作用抑制剂试验分析 P450 的作用。黄孢原毛平革菌降解菲的效率与产物

培养基,黄孢原毛平革菌,波长,振荡培养

0200 250 300 350 400波长(nm)0.000200 250 300 350 波长(nm)0接种至 LN 培养基在 37℃130r/min 振荡培养 60h 后，投加菲 112μmol/L图中产物编号与图 6.13 相对应.14 黄孢原毛平革菌 LN 培养基中菲降解产物的紫外吸收光谱
【学位授予单位】：清华大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：X172

【引证文献】