邻硝基苯甲醛高效降解菌株Pseudomonas putida ONBA-17分离、生物学特性及废水处理生物强化研究

发布时间：2020-03-21 06:08

【摘要】：随着我国工业化进程的加快，有机工业合成废水的排放量越来越大，已对环境造成了严重的污染，威胁到人类生命健康。邻硝基苯甲醛(o-nitrobenzaldehyde，ONBA)作为一种重要的有机精细化工中间体，广泛用于医药、染料和有机合成，工业需求量十分大。但由于其生产过程伴随着大量污染物质的产生，发达国家已将其生产线转移到发展中国家(污染转移)，这一点在我过东南部地区尤为明显。为揭示其对环境的危害，为今后实施的中试乃至工业化规模相匹配的(同类)废水的活性污泥法处理提供一定的设计和运行参考依据；并在研究实施生物强化可行性的同时，从活性污泥相的构成变化、区系变化及优势种群微生物的分离和特性研究等方面着手，试图探寻相关的评判依据、理化基础和科学指引，我开展了本项研究。本研究从邻硝基苯甲醛工业废水水质特征、组份及ONBA的毒性调查入手，证实其具有高COD_(Cr)、高悬浮物含量、高盐和着色(棕红)等特点；水相部份含有2-乙基辛醇、ONBA、邻硝基苯甲醇、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸二异辛酯等有机物，其中又以ONBA为主；经急性毒性试验分析，发现其半致死剂量(LD_(50))分别为291.84mg／kg(经灌胃给药途径)和172.98 mg／kg(经腹腔注射给药途径)，依据急性毒性分级标准，将其毒性评定为中等毒性。在对其危害和污染特征有所了解之后，在实验室条件下构建起数套序批式反应器(Sequencing batch reactor，SBR)，并分别以水力停留时间和污泥停留时间为变量研究了活性污泥量与COD_(Cr)及总氮去除率之间的关系。得到了能为实际工程设计提供重要参考依据的水处理模型——S_e=K_s(1+6·θc)／[θ_C(Y·K-b)-1]=996(1+0.197θc)／(0.73θ_c-1)和X=Y(S_0-S_e)·θ_C／θ_H(1+6·θ_C)=0.342(S_0-S_e)·θ_C／θ_H(1+0.197·θ_C)。在对处理前后反应器中活性污泥变化的研究中发现：与接种污泥相比，驯化污泥在沉降性能方面有所提升。进一步研究发现，沉降性能的提升与污泥多聚物中蛋白质／碳水化合物比值下降有关；活性污泥结构逐渐密实化，丝状菌比例有所下降；微生物区系结构发生显著变化。分别运用荧光原位杂交和变性梯度电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技术揭示了活性污泥中微生物区系的变化情况。证实当SBR系统取得预期处理效果后，活性污泥中的优势微生物种群为Beta和Alpha变形菌。而将基于原位分析和PCR扩增分析的上述两种方法用于同一区系变化的研究，其所得结果更具说服力和全面性。为实现ONBA的特异降解，并为后续生物强化的实施提供种源，我以活性污泥为初始接种物进行了降解菌的分离，得到多株具有ONBA降解能力的细菌菌株。经比较分析后，选取其中一株编号为ONBA-17的菌株进行后续研究．该菌株能在12 h内降解100 mg／mL的ONBA，并具备一定的芳香化合物降解谱；菌体最适生长温度为28℃；最适生长pH值为7.6；最适碳源为果糖，对果糖和甘露糖等简单碳源的利用要好于二糖碳源(如乳糖和蔗糖)；最适氮源为酵母膏，单一组份氮源中氯化铵最易为菌体所利用；最适生长盐浓度在3.5％附近，属中度嗜盐菌；能耐多种重金属和抗生素。在对其培养特征、生理生化特性、16S rDNA序列、G+C mol％含量及DNA-DNA杂交研究和分析之后，将该菌株鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，命名为Pseudomonas putida ONBA-17。随后，又对其粗酶提取物进行了研究，发现粗酶液最适作用温度和酸碱环境分别为30℃和pH7.4．构建了粗酶液反应体系；研究了金属离子、EDTA和表面活性剂对其活性的影响。结果表明，Li~+、Ni~(2+)和Co~(4+)对酶促反应有较强抑制作用，而Ca~(2+)、Mg~(2+)和Mn~(2+)则起激活作用。以吐温20、吐温80和SDS为代表的表面活性剂对粗酶液存在很强的抑制作用。其中SDS能够完全抑制其活性，，EDTA也抑制了约一半左右的酶活；证实负责ONBA降解的酶(系)属胞内酶。此外，还对其降解途径和降解基因定位进行了研究，初步判断该降解基因存在于菌体染色体之上。通过三亲结合的方法，将外源gfp基因插入了P．putida ONBA-17的染色体中，并同过在固体和液体LB培养基中的连续传代，证实了插入片段的稳定性；在对SBR反应器中的活性污泥施行生物强化后发现，实行生物强化处理(接种标记菌株)能明显缩短系统启动期。但与对照相比，其在耐负荷冲击和运行稳定性方面略逊一筹。意味着在未经某一(或几)种污染物污染的环境系统中，蕴含有足够的基因种类(或遗传多样性)以应对类物质，前提是给系统以足够的适应驯化期。通过荧光和激光共聚焦(Confocal laser scanning microscopy，CLSM)显微镜观测，监测了标记菌株在反应器中的存活情况。再结合反应器的运行效果及标记菌株的平板计数情况，认为接种物环境适应和系统保留能力、与土著微生物的竞争能力及抗原生动物捕食能力与接种物存留和生物强化效果密切相关。为了研究施行生物强化对活性污泥中微生物区系造成的影响，并为后续优势菌群的分离提供一定的指导依据，我通过DGGE技术监测了反应装置中细菌区系的演替情况。发现生物强化较处理环境对污泥中微生物区系的影响远小。不同处理的反应器的DGGE图谱仅在初始阶段和末期有所区分，一部分α、β变形菌及未知菌(群)逐渐成为了运行系统中的优势菌群。通过直接平板涂布法获得了4株差异明显的细菌菌株，并对其进行了鉴定和特性研究。结果表明，编号依次为R，S，W和M的菌株其分类地位分别归属Exiguobacterium sp．，Pseudomonas sp．，Bacillus cereus和P．aeruginosa；这4株菌与DGGE图谱分析中的部分条带的16S rRNA基因v3区序列同源；有着良好的聚凝能力和疏水性能。聚凝指数分别为79.5％，83.1％，90.0％和81.2％，远较50％的界定标准高；上述菌株与降解菌株ONBA-17之间无显著ONBA降解能力、成膜能力及聚凝能力促增作用。但菌株R与ONBA-17和S之间有明显的生长促增作用。通过后续主要碳源利用实验及培养液的GC-MS分析，发现混合培养较单菌培养在物质代谢利用方面存在差异。在本研究之前，国际上未见ONBA降解菌及其生物强化研究的相关报道，国内也无此类废水的相关处理模型。因而，本研究具备一定的创新性和理论价值，能为后续研究提供一定的研究基础，起到抛砖引玉的作用。
【图文】：

流程图,SBR工艺,流程

率; 克服了传统氧化沟占地面积大的问题 "2.1..2 3.6 导管式氛化沟该工艺是美国于 1980 年开发的一种高效节能系统"它以导管式曝气器(Dar tf TUbeeA atr o,r D 八T ) 代替传统的转刷曝气器 "根据曝气区和沉淀区的关系可分为整体式和独立式两种 "整体式中氧化沟与沉淀池合建, 污泥自动从沉淀池回流至氧化沟 , 不需要污泥回流泵 "独立式中氧化沟与沉淀池分开建立而形成两个独立的单元 "2.1..2 4 序批式反应器 (sqe uen inc g Btahc Recta o,r sBR ) 污水生物处理技术序批式活性污泥法早在 19 41 年户Jdem 和 LOcket发明活性污泥法时就采用了这种处理系统 "目前, 该工艺主要在美国 ! 澳大利亚和日本等国应用, 主要用于生活污水及工业废水的处理 (特别是处理含有机物的工业废水)"总体来看, 我国 SBR 实际工程应用水平与国际水平相比还有一定差距, 主要体现在新型曝气器和潍水器的研究开发与应用 ! 自动化水平! 工艺设计标准和在线监测等方面, 但随着国内相关行业的迅速进步这一差距正在缩小 "该工艺将整个运行周期分作 5 个阶段, 即进水 ! 反应 ! 沉淀 ! 出水和闲置, 属于单池生物系统 , 运行流程见图 1一3 "

联机分析,有机物质,水样

邻硝基苯甲醛高效降解菌株乃已侧幻柳加s州汕 ONBA .17 的分离! 生物学特性及废水处理生物强化研究的将来统一规划入工业园区 (设污水处理厂), 因而其第二类污染物最高容许排放浓度应准照 5污水综合排放标准 6 ("B879 8一19 6) 中的三级排放标准, l "通过 G G M S 联机分析, 确定了水相中含有的部分有机物质种类 "它们是 2一乙基辛醇(2一eht yl hxe ano l) ,ONB A ,尼古丁(-伪tine ), 邻硝基苯甲醇(o 一-trobe ~ m ethnoa )l,邻苯二甲酸二丁酷(ibd tu yl hP thalta )e 和邻苯二甲酸二异辛酷但150山比尹Ph thalate) , 所对应的出峰时间分别为4.19, 6.4, 6.71, 7.1, 9.71 (10.20) 和 12.89 .(见图 1#2)"其中,id ub yt l pth aita "之所以对应两个峰是因为这两个峰的检索分析表中 dibutylphth iata "均为最大可能性物质 "
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：X172

【参考文献】