真菌对重金属的抗性机制和富集特性研究

发布时间：2020-03-27 21:12

【摘要】： 重金属及其化合物在工业中被广泛应用,导致大量含重金属废水、废渣产生,对环境造成严重污染。在重金属污染治理中,如何降低或消除重金属的毒性是减小重金属污染危害的关键。自然界中许多菌种具有重金属抗性和富集能力,因而用微生物法治理重金属污染具有较好的前景。本文选用几株不同形式的真菌用于重金属离子的富集和吸附,分别对生长中的菌体对重金属的抗性机制、富集特性,活性菌体和非活性菌体的吸附特征和机理进行了详细研究与探讨。从湖南省岳阳市临乡铜锌尾砂坝的尾砂中分离筛选出一株对Cu(II)和Zn(II)具有高抗性的富集菌CTB430-1,通过细胞形态观察、ITS基因序列测定和系统发育分析,被鉴定为黄曲霉(Aspergillus flavus)。菌株CTB430-1对Cu(II)和Zn(II)具有较强的抗性,Cu(II)和Zn(II)对其最低抑菌浓度分别为400和800mg/L。选择的对比菌株黑曲霉(Aspergillus niger)的最低抑菌浓度分别为200和300mg/L,其对两种重金属的抗性相对较弱。CTB430-1对Cu(II)和Zn(II)的富集量分别在浓度为200和250mg/L时达到最大,为30.82和40.37mg/g。A. niger分别在150和250mg/L时达到最大,为8.89和22.80mg/g。对菌体CTB430-1和A. niger富集Cu(II)和Zn(II)的影响因素如溶液初始pH值、重金属初始浓度、共存离子、孢子液接种量、温度进行了研究。结果表明,溶液初始pH值对两个菌株的生长和富集量均有重要影响,pH≤2.0时抑制菌体的生长;随pH值在2.0-5.0范围内增加,菌体生长量和富集量均增加;在pH值为5.0时均达到最大。在Cu(II)和Zn(II)为25-100mg/L范围内,重金属浓度增加对菌体CTB430-1和A. niger生长的有潜在抑制作用,导致菌体生长延滞期增加,两种菌体生长量均在5d时达到平衡;两种菌体对不同浓度Cu(II)和Zn(II)富集均分别在4d和5d时达到平衡。在Cu(II)和Zn(II)共存系统内,除在Cu(II)+Zn(II)浓度为(25+25)mg/L和(25+50)mg/L时对A. niger菌体生长有较小的促进作用外,对两种菌体生长抑制作用均大于单离子系统,金属单离子浓度较高时,其竞争能力较强,富集能力相对较大。菌体CTB430-1和A. niger在Cu(II)和Zn(II)溶液的生长量和富集能力随接入的孢子液体积增加而增加,在体积为1mL时达到平衡。两菌体的生长量均在25℃-30℃之间达到最大,富集量在30℃-35℃之间达到最大。电镜扫描和透射分析CTB430-1和A. niger菌丝体富集Cu(II)和Zn(II)前后的表面特征和内部结构变化,表明菌体生长受重金属毒害作用可能破坏了菌体表面结构,或菌丝体表面可能吸附了部分重金属而使表面模糊;富集过程主要由表面吸附和胞内富集两部分组成。红外光谱分析表明菌体CTB430-1对Cu(II)的富集并未破坏其本身的结构,羟基是CTB430-1吸附或络合或螯合Cu(II)的主要活性基团,而A. niger吸附是由菌体中多糖类基团上的P作为配位原子与Cu(II)配位络合所造成。对CTB430-1和A. niger对Cu(II)和Zn(II)抗性机制进行研究。结果表明,高浓度的Cu(II)和Zn(II)显著抑制了CTB430-1和A. niger生长,导致可溶性蛋白含量下降,还原型谷胱甘肽(GSH)含量显著增加,说明GSH缓解了重金属对细胞的氧化损伤作用;且超氧化物岐化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性随重金属浓度增加显著增加,这是两种菌体抵抗过氧化的主要表征之一,CTB430-1的酶活增加较大,说明CTB430-1对Cu(II)和Zn(II)的抗性较A. niger强。Cu(II)和Zn(II)作用时,可诱导CTB430-1和A. niger菌体丙二醛(MDA)含量增加,Cu(II)作用时显著增加,说明活性氧自由基介导的膜质过氧化作用是Cu(II)导致CTB430-1和A. niger细胞损伤的主要原因。就外源NO对Cu(II)作用下菌株CTB430-1和A. niger抗氧化系统的影响进行研究。结果表明,低浓度NO处理(0.1mmol/L的硝普钠(SNP)溶液)时,能促进CTB430-1和A. niger生长。外源NO可能通过减缓可溶性蛋白质的降低,促成GSH的合成,诱导菌体内SOD和CAT活性增强来增加菌株CTB430-1和A. niger的抗氧化能力。低浓度的NO可有效降低两菌体内MDA的含量来减缓Cu(II)的毒性,但高浓度NO(0.3mmol/L的SNP)的缓解作用不明显。对活性黑曲霉(Aspergillus niger)对Cd(II)和Zn(II)的吸附特征进行研究。结果表明,A. niger对Cd(II)和Zn(II)吸附的最佳pH值分别为4.0和6.0;其最佳吸附温度和转速范围分别在25-30℃和100-150r/min。在最佳条件下,吸附量在Cd(II)和Zn(II)的初始浓度分别为75和150mg/L达到最大,分别为17.35和24.60mg/g;A. niger对两种重金属的吸附均在24h达到平衡;对Cd(II)和Zn(II)吸附均符合Langmuir等温模型,吸附过程可由二级速率动力学方程描述。本文还对非活性简青霉(Penicillium simplicissimum)吸附Cd(II)、Zn(II)和Pb(II)的吸附等温线、动力学和热力学进行了研究,同时就溶液初始pH值、重金属初始浓度、吸附剂用量、吸附时间、温度和共存离子对吸附的影响进行了研究。结果表明,P. simplicissimum对Cd(II)、Zn(II)和Pb(II)吸附均符合R-P等温模型,D-R方程的平均自由E值说明了吸附过程可能存在化学离子交换;不同温度条件下的吸附动力学可由准二级速率方程描述;吸附热力学常数ΔG o、ΔHo和ΔS o数值表明该吸附反应是自发过程,吸热反应。
【图文】：

菌株,小梗,菌丝,多次分离

实验中经多次分离筛选，得到 1 株对 Cu(I为 CTB430-1。菌株在土豆培养基中经多次分满整个平面皿，菌丝疏松，表面呈黄绿色，背，菌丝多分枝，具有隔膜，有大量的分生孢子囊表面又生出呈放射状排列的小梗，每个小梗色。根据菌落、细胞形态特征，初步判定为曲.3.2.2 ITS 序列测定结果对筛选的菌株进行 ITS 区域扩增，使用 TaCode No. D317）PCR 扩增目的片段，以 ITSrimer 为引物，扩增目的片段，，取 5μl 进行琼脂

菌株,引物

图 2.2 菌株 CTB430Fig. 2.2 The PCR recycle produc以 Seq Forward primer 为引物对 CT如图 2.3 所示。TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATAGCCCAACCTCCCACCCGTGTTTACTCCATTCATGGCCGCCGGGGGCTCTCACACCACGAACTCTGTCTGATCTAGTGAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCCAGCGAAATGCGATAACTAGTGTGATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCACGGTCCGGGGGGGACGGGCCCCAAAGGC
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：X172;X505

【引证文献】