对甲基苯磺酸高效降解菌的筛

发布时间：2020-03-31 11:25

【摘要】：对甲基苯磺酸(PTS)是一种重要的化工合成原料,被广泛用于医药和农药合成过程。大量研究表明,对甲基苯磺酸具有较强的生物毒性作用,不易生物降解,含对甲基苯磺酸的废水进入环境后会对生态环境和人体健康造成严重危害。因此,分离对甲基苯磺酸高效降解菌,研究其降解过程和代谢机制,开发含PTS废水生物强化处理技术,具有重要的理论意义和实际应用价值。目前,国内外关于PTS微生物降解和代谢机制的研究较少,尚无将PTS高效降解菌应用于废水生物强化处理工程的报道。本文筛选到一株能够高效降解PTS的Hydrogenophaga属菌株QY7-2,研究了 QY7-2对PTS的代谢途径、降解基因和降解酶,丰富了 PTS降解微生物种质资源库;将高效菌株QY7-2应用于实验室规模的序批式生物膜反应器,研究高效菌株的定殖情况和反应器的运行工艺参数,并将高效菌株应用于含PTS的农药生产废水实际处理工程中,进行生物强化处理,实现了废水中PTS的有效去除,为废水特征污染物的处理和达标排放提供了技术支撑。主要研究内容及结果如下:1、PTS降解菌株的分离和降解特性研究以PTS为唯一碳源,通过连续传代富集技术获得能够降解PTS的富集液,从富集液中分离到菌株QY7-2。根据菌株QY7-2的生理生化和16SrDNA基因同源比对,将菌株鉴定为均Hydrogenophaga s.,与模式菌株Hydrogenophagaatypical BSB 41.8T 同源性最高,同源性为98.34%。菌株QY7-2可以在21h内完全降解200mg/LPTS,其最适条件为初始pH值为6.0-7.0,温度为30℃-35℃.利用液相色谱-质谱联用技术对PTS降解过程中的代谢产物进行鉴定,推测QY7-2降解PTS的代谢途径为:首先,侧链甲基在氧化酶的作用下被氧化,生成对羧基苯磺酸;而后羧基对位上的磺酸基在双加氧酶的作用下氧化生成3,4-二羟基苯甲酸;最终被矿化生成C02和H20。菌株QY7-2对PTS降解的动力学研究表明,降解过程符合Monod方程。2、PTS降解关键基因的克隆及表达利用Illumina Hiseq 2000测序技术测定了菌株QY7-2的基因组框架图。菌株QY7-2基因组大小为4911693bp,编码的ORF有4590个,G+C含量为68.77%。与已报道的PTS降解相关基因进行比对,在菌株QY7-2体内定位到与甲基氧化相关的疑似基因簇ptsABCD。比对结果显示基因ptsA和ptsB编码的蛋白序列PtsA和PtsB与已经报道的菌株T-2中4-甲基苯磺酸甲基单加氧酶的氧化组分和还原组分分别有99%和97%的同源性,而基因ptsC和ptsD编码的蛋白序列PtsC和PtsD与菌株T-2中的4-醛基苯磺酸脱氢酶和4-羟甲基苯磺酸脱氢酶均显示出99%的同源性。通过构建pET-28a表达质粒,在E.coli BL21中成功表达并通过镍柱纯化了 PTS降解的关键酶PtsA、PtsB、PtsC和PtsD。将纯化的酶在体外进行降解实验,结果发现PtsAB可以将对甲基苯磺酸氧化成对羟甲基苯磺酸,比活力为161.5±3.3 nmol min-1 mg-1;PtsD可以将对羟甲基苯磺酸氧化成为对醛基苯磺酸,比活力为429 ± 2.6 nmol min-1 mg-1;PtsC可以将对醛基苯磺酸氧化成为对羧基苯磺酸,比活力为481± 2.9 nmol min-1 mg-1。3、实验室规模序批式生物膜反应器(SBBR)处理PTS废水研究以分离到的PTS降解菌株为强化菌剂,利用序批式生物膜反应器考察了 PTS降解菌剂强化处理含PTS废水的有效性。结果表明,通过投加强化菌剂,可以有效提高废水中COD和PTS的处理效率。通过荧光定量PCR技术监测了启动过程中菌株QY7-2在生物膜中上的生长情况。利用Design Expert 8.0.5软件Box-Behnken方法设计了三因素三水平的实验,以COD去除率和PTS去除率为响应值,采用响应曲面法对工艺运行参数进行了双目标优化;分析了运行温度、pH和水力停留时间(HRT)间的相互关系和对两个响应值的影响度;得到了 COD去除率和PTS去除率的二次多元回归拟合模型,通过模型预测确定了最优反应条件为温度为31.77℃,pH为6.69,HRT为2.49d,最优运行效果为COD最大去除率为96.04%,PTS最大去除率为91.43%。4、生物强化技术处理PTS废水工程化应用结合菌株QY7-2强化处理PTS废水的前期研究结果,将分离到的PTS高效降解菌应用于江苏某农药生产企业废水处理工程中(处理规模700 m3/d),改善了原有处理设施的运行效果,为同类废水生物强化处理提供了技术支持。采用PTS降解菌剂强化前,企业原有系统对有机物和PTS的去除率分别为78.32%和7.07%;采用PTS降解菌剂强化后,有机物和PTS的去除率分别为97.12%和89.24%;出水中有机物浓度由950mg/L-1050mg/L 下降至 100mg/L-200m/L,出水中 PTS 浓度 50mg/L-80mg/L。同时利用高通量测序技术,对生物强化系统不同运行阶段的活性污泥样品进行16S rDNA扩增子测序。结果显示运行稳定后污泥样品中微生物种群丰度和多样性与启动时相比均明显升高;根据序列在门水平上的分类可以看出,生物强化体系启动开始、调试完成以及稳定运行一段时间后的污泥体系微生物群落结构存在一定的差异,变形菌门(Proteobacteria)相对丰度在不断增加,其中丙型变形菌门(Gammaproteobacteria)相对丰度始终明显增加,α型变形菌门(Alphaproteobacteria)在满负荷稳定运行一段时间后明显下降;同时拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度在运行过程中也始终呈下降趋势;根据序列在属水平上的分类,噬氢菌属(Hydrogenophaga)的相对丰度在生物强化系统运行过程中相对丰度不断增加,启动阶段结束时Hydrogenophaga进水端和出水端的相对丰度已达到5.241%和6.129%,而到稳定运行阶段的相对丰度已达到14.338%和9.542%,可见投加的高效降解菌株可以很好的在强化系统中定殖,形成了稳定的微生物群落体系,表现出高效稳定的生物强化作用。
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Ｔ－ＲＦＬＰ技术是广泛应用于微生物群落结构解析的一种分了？指纹图谱技术，，被逡逑公认为是进行复杂环境微生物群落研究的强有力工具之一［８４：８５］，其基本原理及操作流逡逑程如图１－７所示。逡逑＿邋一逦ｒｎＴｆｍｉＴ逡逑（0）邋Ａ１逦0丨丨】

本文编号：2609013