Comamonas sp. MQ及其强化体系合成靛蓝类色素的研究

发布时间：2020-04-01 22:04

【摘要】：吲哚及其衍生物是焦化废水中典型的氮杂环化合物,利用微生物法能将其转化为靛蓝、靛玉红等常见色素,不仅能实现废水中吲哚的有效处理,而且能够合成有工业应用价值的化合物,具有环境与经济的双重效益。目前,靛蓝类色素的微生物合成多数集中在纯菌(野生菌或重组大肠杆菌)的研究,但分离的菌属种类相对单一,主要为Pseudomonas属,而有关微生物群落合成靛蓝类色素的研究尚未见报道。本论文从野生菌、重组大肠杆菌以及活性污泥体系三个方面对微生物合成靛蓝类色素的特性进行研究,主要内容如下：针对靛蓝合成菌属资源相对匮乏的现状,有必要筛选新型的菌株。分别采用萘+吲哚(G1)和苯酚+吲哚(G2)对活性污泥体系进行驯化,结果发现不同芳香化合物刺激的污泥体系均能转化吲哚合成靛蓝,且G1具有更好的靛蓝合成能力,并从中筛选得到靛蓝产生菌MQ。由16S rRNA基因序列分析表明菌株MQ归属于Comamonas属,是一株新颖的靛蓝产生菌。分别考察菌株MQ生长细胞和休眠细胞转化吲哚合成靛蓝的基本特性,结果发现：生长细胞合成靛蓝的最适吲哚浓度为50mg/L,萘浓度为200mg/L,得到的靛蓝产量为32.2mg/L；休眠细胞合成靛蓝的最适温度为25℃,摇床转速为150r/min,菌量为OD6602.16,吲哚浓度为201mg/L,反应体系pH为6.9,生成的靛蓝为53.1mg/L。利用薄层色谱、液相色谱-质谱联机等分析手段对菌株MQ转化吲哚合成的产物进行鉴定,结果表明合成的蓝色产物为靛蓝,并推测可能的代谢途径：吲哚在萘双加氧酶的催化下生成顺式-吲哚-2,3-二氢二醇,后者自发脱水形成吲哚酚,两分子吲哚酚在空气中氧化二聚生成靛蓝。利用热不对称交错PCR和同源扩增的方法从菌株MQ的基因组DNA中成功扩增到完整的萘双加氧酶编码基因,全长约为5.2kbp。对萘双加氧酶基因进行序列分析,结果表明其为nag型基因簇,基因排列顺序为：nagAa-nagG-nagH-nagAb-nagAc-nagAd。将该基因导入到Escherichia coli BL21(DE3)中,构建重组大肠杆菌ND_IND,利用SDS-PAGE分析及粗酶活性检测表明萘双加氧酶得到成功表达。重组大肠杆菌ND_IND能够转化吲哚、甲基吲哚、硝基吲哚、氯代吲哚等多种吲哚衍生物合成不同颜色的物质,利用紫外-可见全波长扫描、液相色谱-质谱联机等分析手段对转化产物进行鉴定,结果表明生成的主要产物为含有不同取代基的靛蓝类色素。考察重组大肠杆菌ND_IND转化吲哚及色氨酸合成靛蓝类色素的基本特性。以吲哚为底物时,菌株ND_IND合成靛蓝的最适条件为：菌量OD6002.50,吲哚浓度300mg/L,葡萄糖浓度30g/L,反应体系pH7.0,在此条件下靛蓝产量为205.1mg/L。考察金属离子以及典型焦化废水组分对靛蓝合成的影响,结果发现大部分金属离子以及喹啉对靛蓝合成具有明显的抑制作用。以色氨酸为底物时,菌株ND_IND合成靛蓝类色素的最适萘双加氧酶诱导条件为：诱导时间点OD6001.20, IPTG浓度0.50mmol/L,诱导温度30℃；利用表面响应法对色氨酸培养基进行优化,分别得到150.2mg/L靛蓝和9.4mg/L靛玉红；为进一步提高靛玉红的产量,在培养基中额外投加2-吲哚酮和靛红,结果发现诱导1h后加入500mg/L2-吲哚酮能得到58.0mg/L靛玉红,产量提高了6.2倍。将野生菌MQ(B2)以及重组大肠杆菌ND_IND (B3)投加到活性污泥体系中,首次对活性污泥体系合成靛蓝的特性进行研究。结果表明,菌株强化组B2与B3的靛蓝产量明显高于对照组(B1),且B3合成的靛蓝产量最高。采用Illumina高通量测序技术对微生物群落进行分析,结果显示强化菌MQ在污泥体系中能维持一段时间,而强化菌ND_IND则基本不能生存。QPCR分析显示萘双加氧酶基因(nagAc)在运行初期与靛蓝产量具有显著的正相关,表明强化菌在初期靛蓝合成中起着重要的作用。降趋势对应分析和非参数检验表明,三组体系的微生物群落结构在运行过程中发生了显著的变化。Comamonas、Alcaligenes、Aquamicrobium和Pseudomonas是三组体系中主要的菌属(平均丰度1%),其中典型的靛蓝产生菌Comamonas和Pseudomonas与靛蓝产量没有明显的正相关,而Alcaligenes和Aquamicrobium与靛蓝产量则存在显著的正相关,这些菌属在靛蓝合成研究中并未有相关报道,可能是新型的靛蓝产生菌。
【图文】：

合成方法,BASF公司,生命周期评价,德国

德国BASF公司利用生命周期评价方法（LCA)对不同靛蓝合成方法进行了生态效益分析，结果如图1.2所示EncruAconsii mption./ v'lU ? \ Materials liuhuo frmn plantsLniissMMi#C 广\ \ ll / Iiuliuo f'niMi cliciiik'iil sMithcsiNV / \ / /V \ / \ / / Indigo from hiutechnuln^icalV* j/ \y' / pnuliictiiHi ^ Riskixik'iilial l)"l ⑶图1.2不同靛蓝合成方法的生态效益分析Fig. 1.2 Eco-efficiency analysis of different types of indigo production-3-

合成功能,编码基因,单加氧酶,双加氧酶

典型的单加氧酶如细胞色素P450单加氧酶、苯酷经化酶、黄素单加氧酶、甲苯单加氧酶等（图1.4);根据加氧酶组成成分的不同，这些酶可以划分为多组分酶和单组分酶，其中萘双加氧酶、苯酴轻化酶、甲苯单加氧酶等为多组分酶系，细胞色素P450单加氧酶、黄素单加氧酶等为单组分酶系（图I.4)P3-39.40,42.44,65]^研究人员利用构建的重组大肠杆菌对这些功能酶进行外源表达，进而用于靛蓝类色素的合成，在靛蓝合成机理、条件优化等方面^u展了大量的工作。nail{55^thn DioxygenascMonooxygenaseMX): Niiphtlialeiic (li"\ygt‘iiast- IJphA: Biplienvl dioxvociu'iise l liriA: Tctraliii ilioxygcnase _I PHO: Pheiiol hydroxylase TMO: Ibluenc monooxygenase KMC): Flavin inoiiooxygeiiases ■1*450: ( ytochioiiie P45i) monooxygenascs .图1.4典型的歐蓝合成功能酶及其编码基因簇Fig. 1.4 Typical enzymes and the corresponding gene clusters responsible for indigo production(1)萘双加氧酶萘双加氧酶是最早应用于敲蓝类色素合成的加氧酶。萘双加氧酶（EC 1.14.12.12)，又名萘-1,2-双加氧酶，是一类多组分双加氧酶，通常包含一个NADH氧化还原酶、一个铁氧化蛋白和一个包含活性位点的铁-硫蛋白[66，，67]。萘双加氧酶也是一类典型的Rieske型非血红素铁加氧酶，催化主体部分由大亚基和小亚基（又名a亚基和A亚基）构成一个《3/?3的六聚体结构，其中大亚基含有一个Rieske型[2Fe-2S]中心和一个非血红素单-9-
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：X784;X172

【参考文献】