海州香薷耐铜性和金属硫蛋白基因克隆及功能分析

发布时间：2020-04-01 23:06

【摘要】：重金属对土壤和水体的污染是主要的环境问题之一。当重金属在生物体内积累超过一定量时，即会对生物产生毒害。同时重金属具有不可降解性，对土壤及水体的污染，严重影响农产品的品质，并通过食物链危及人类的健康。植物体在适应环境的过程中，逐渐形成了一系列的适应性机制。植物细胞对重金属毒害的耐性机理之一是合成一些配位基团，与重金属离子螯合，从而降低细胞质中重金属的自由离子活度。植物细胞中能与重金属结合的配位基团包括氨基酸、有机酸等小分子物质以及金属硫蛋白(MTS)、金属螯合肽(PCs)等小分子量的多肽。本研究通过水培的方法研究了海州香薷(Elsholtzia haichowensis)、野草香(Elsholtzia cypriani)及香薷(Elsholtzia ciliata)三种香薷植物对铜吸收及耐性的比较，分析了铜对三种香薷种子萌发、幼苗生长及营养元素吸收的影响，同时从海州香薷中获得了EhMT1基因的全长cDNA，并对EhMT1基因功能进行了初步分析。实验结果表明，50μM Cu处理降低了野草香和香薷胚根及下胚轴的生长，根伸长完全受到抑制；在相同浓度的Cu处理下，海州香薷的生长没有受到显著抑制，且地上和根系铜浓度都显著高于野草香和香薷。当100μM Cu处理时，海州香薷地上部和根系的铜浓度最高可达217和13170 mg/kgDw。铜处理能够显著提高海州香薷叶片和根系可溶性蛋白含量，对野草香和香薷没有显著的促进作用。结果显示，海州香薷比野草香和香薷具有较高的耐性，蛋白可能参与了海州香薷的耐铜性。本研究又以海州香薷为实验材料，以5个MT基因cDNA序列(GenBank中登录号分别为L27813、L02306、X95709、X77254、D78491)为基础，设计简并引物，运用RT-PCR和RACE技术，首次从海州香薷中扩增获得了MT基因cDNA，，序列全长为581bp，命名为EhMT1。该cDNA序列经BLAST程序查新确认后在GenBank中登录，登录号为DQ059081。EhMT1包含一个225bp的开放阅读框，编码74个氨基酸；同时扩增到了一段855bp的序列，经序列比对确认是EhMT1的基因组DNA，包含2个内含子和3个外显子。海州香薷金属硫蛋白N-端和c-端各含有6个cys，这12个cys在N-端和C-端的排列分别为CXCXXXCXCXXXCXC和CXCXXXCXCXXCXC(其中X代表任意氨基酸)，这种排列结构表明海州香薷EhMT1属于MT1类。序列比对表明，本研究预测的EhMT1蛋白与其他植物金属硫蛋白在核苷酸和氨基酸水平都表现很高的相似性，与Mimulus guttatus(玄参科沟酸浆属植物)MT的相似性最高为75％。组织表达分析表明，EhMT1主要在根中表达，叶片中也有表达，而在茎中检测不到该基因的表达。半定量RT-PCR结果显示，Cu胁迫能够上调EhMT1基因的表达，同时EhMT1基因还受热激处理和氧化胁迫的诱导。通过构建原核表达载体，进行EhMT1基因的原核表达分析。经IPTG诱导，得到了约18kDa的融合蛋白。在各种胁迫处理下，转化pET-30a-EhMT1的大肠杆菌重组子要比转化pET-30a空载体的对照菌生长明显旺盛。结果表明，转入EhMT1基因，提高了大肠杆菌对各种非生物胁迫的耐性。构建EhMT1基因瞬时表达载体转化洋葱表皮细胞，对GUS报告基因染色发现海州香薷EhMT1编码产物主要定位在洋葱表皮细胞的细胞质中，这与前人报道的结果是一致的。另外，我们构建了植物表达载体pBI121-EhMT1用于转基因烟草，目前已获得了EhMT1基因过量表达的烟草转基因植株。以转基因烟草试管苗为材料进行耐铜性分析，与对照相比，转入EhMT1基因不仅提高了烟草转基因植株对铜的耐性，而且也提高了烟草植株体内Cu的积累。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：Q78;X173

【参考文献】