典型三苯甲烷还原酶的细胞表面展示及新型双功能染料还原酶的挖掘和底物识别机制研究

发布时间：2020-04-11 22:24

【摘要】：印染废水水量大、水温高、成分复杂等特性对现有的生物处理方法提出了严峻的挑战,因此寻找高效、稳定、低成本、广谱的印染废水处理方案成为了当务之急。本研究旨在通过构建染料高效降解酶的表面展示系统,既可以解决染料跨膜运输的难题,又可以降低废水处理成本,为染料降解酶的实际应用提供理论基础。同时本研究通过基因组挖掘获得了一个可以同时降解三苯甲烷和偶氮染料的还原酶,并部分阐明了其底物识别机制,对具有底物广谱性的染料降解酶类的改造具有重要意义。论文主要研究结果如下：1)重组三苯甲烷还原酶CsTMR为同源二聚体,最适pH和温度分别为8.5和55℃,在45℃以下处理半小时后保持稳定,在5.0-10.0的pH范围内处理后可以保持其初始活性的50%以上。总体而言,该酶活性和稳定性较好,适合作为固定化或表面展示的对象来为染料废水的降解研究提供新的思路。2)以来自Pseudomonas boreal is的冰晶核蛋白N端(InaPb-N)作为锚定蛋白,构建CsTMR大肠杆菌表面展示系统。约有85%的外源蛋白被成功展示在大肠肝菌外膜上,表面展示CsTMR对孔雀石绿的脱色速率达到了640 μmol min-1 g-1DWC。表面展示酶的稳定性比游离纯酶显著提高,特别是长期稳定性。在我们进一步尝试构建辅酶再生体系,利用InaPB-N介导的葡萄糖脱氢酶DS255表面展示系统时,在胞外检测不到GDH活性,说明DS255没有被成功展示。3)利用cotG作为分子载体构建枯草芽孢杆菌芽孢表面展示系统,将CsTMR和DS255成功展示在芽孢表面。与纯酶相比,两种表面展示的蛋白对pH和温度的耐受范围更广,且具有更好的稳定性。利用表面展示的CsTMR和DS255的芽孢,作为全细胞催化剂构建辅酶再生体系,根据不同的参数得出整个体系需要较高比例的芽孢展示DS255才能够满足CsTMR对于NADH的需求,从而达到较高的降解速率。4)以CsTMR氨基酸序列为探针,通过数据库挖掘,从Geobacillus thermoglucosidasius C56-YS93的得到一个可能编码三苯甲烷还原酶的基因,根据其底物特异性将其命名为GtAZR。重组GtAZR在pH5.5和40℃C条件下具有最大活性,在低于65℃C的温度下保持稳定,同时它也具有较广的pH耐受范围。该酶对有机溶剂有非常高的耐受性。此外,GtAZR底物谱较广,能同时降解三苯甲烷和偶氮类染料。GtZAR强大的稳定性和底物广谱性使它在处理实际混合染料废水中有着极好的应用前景。5)通过同源建模、分子对接、分子动力学模拟和定点突变实验,对CsTMR和GtAZR的底物识别机制进行了初步探索。研究结果显示,GtAZR的第79、80和148位氨基酸残基可能参与其对甲基红的识别,而CsTMR的146位氨基酸可能与其对孔雀石绿的识别有关。本研究从结构的角度部分阐明了GtAZR的底物识别机制,为染料降解酶类底物谱的改造提供了新的思路。
【图文】：

示ＤＮＡ片段与唆菌体的衣壳蛋白基因融合，从而展示在睡菌体表面，通过这种方逡逑法可Ｗ构建氋度多样化的幢菌体突变库，结合氋效的筛选方法获得感兴趣的突变逡逑体（图１－４）。一般通过淘选方法筛选重组VS菌体，利用固定的抗原（底物）与表面展示逡逑１５逡逑

＼逦＼＾邋ｒ逦Ｆｌａｇｅｌｌａｒ逡逑化逡逑图１－５革兰氏阴性菌表面展示系统的常用错定蛋白［１２２］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－５邋Ｓｕｒｆａｃｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ｕｓｅｄ邋ｆｏｒ邋ｔｈｅ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋ｄｉｓｐｌａｙ邋ｓｙｓｔｅｍ邋ｉ打邋Ｇｒａｍ－打ｅｇａｔｉｖｅ邋ｂａｃｔｅｒｉａ邋［１２２］逡逑ＩＮＰ（Ｉｃｅ邋Ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ邋Ｐｒｏｔｅｉｎ）是发现于欧文氏菌、假单胞菌属和黄单胞菌等植物逡逑致病菌的外膜蛋白，在过冷水中促进冰晶的形成造成植物霜害。ＩＮＰ的Ｎ末端结逡逑构域包含Ｈ到四段跨膜区，含有疏水氨基酸并能通过糖基a愔瑧溂〈加胪饽は嗔�，，逡逑Ｃ末端结构域高度亲水并暴露于外部介质中，中也部分包括一系列重复区域作为逡逑化核形成的模板［１４２］。研究发现ＩＮＰ的中也、部分并不是转运所必须的，可能作为间逡逑隔单位调节外源蛋白和细胞表面的距离，缺失中央重复单元的ＩＮＰ截断体也能用逡逑于稳定的表面展示系统的构建，进一步研究发现Ｎ末端结构域可Ｗ单独作为错定逡逑蛋白用于外源蛋白的表面展示（图１－６）。ＩＮＰ己被成功用于果聚糖庶糖酶、^~甲基逡逑纤维素酶、木糖脱氨酶等的展示［１４３－１＾。ＩＮＰ具有表达量大且不影响大肠杆菌生存逡逑力
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X791

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本文编号：2623911