基于微流控的环境微生物基因检测芯片研究

发布时间：2020-04-25 14:22

【摘要】：随着环境科学的日益发展,环境中的微生物对人类社会的影响越来越受到重视,尤其是环境中的致病微生物,容易导致人类疾病和社会恐慌,因此成为了环境生物分析领域的研究热点之一。目前,环境科学已经与化学、生物和微流控等多种技术交叉融合,通过充分发挥各学科的技术优势,极大的促进了环境微生物分析检测的发展。其中,分子生物学分析具有操作简单、灵敏性和特异性高的特点。但是,受到仪器、样品和试剂的使用及成本的限制,在对多种样品进行大量分析时,存在着操作繁琐和成本较高等问题,而且无法满足现场实施分析的需要。因此,亟需一种快速、便携、高通量的检测技术,用于环境致病微生物的现场监测和分析。本论文通过微流控芯片技术和分子生物学技术的结合,以PDMS为材料,构建了一种简单廉价的连续流动式PCR扩增芯片,可以对环境微生物进行快速检测。一次扩增需要的样品和PCR试剂消耗量分别约为0.1ul和2ul。与传统的PCR方法相比,本芯片结构简单,便于携带,可以对多个样品进行流动式分析,而且操作简便,能够初步满足现场检测的需要。在此基础上,我们构建了用于空气中微生物检测的高通量流动式PCR芯片。通过阀门的开启和闭合,对反应液的流动进行控制,实现了以连续流动进样的方式一次针对六种空气中的微生物的检测。从细菌的富集和裂解到芯片PCR扩增完成,耗时约2小时,一次分析需要的样品量仅为013ul, PCR反应试剂约2.5ul,特别适合对珍贵或稀少样品的分析。以大肠杆菌为目标菌株,测得该芯片的最低检测限约为118个细菌。本研究构建的微流控芯片是首个具有直接针对空气中的微生物进行分子生物学分析能力的设备,在对环境气溶胶中的病原微生物的快速分析中将发挥重要作用,通过改进和完善,有望实现环境空气微生物的现场检测和早期预警。为了进一步满足高通量检测的需要,提高检测特异性,我们在常规基因芯片技术的基础上,构建了基于微流控的静态核酸杂交芯片。通过设计针对细菌16SrDNA可变区的寡核苷酸探针,可以实现一次对五种常见环境致病微生物的快速杂交分析。探针的特异性较好,最低检测限与常规的基因芯片技术相当,但试剂消耗和反应耗时分别约为常规方法的10%和50%。我们通过将连续流动式PCR芯片与核酸杂交芯片进行整合,开发了快速、便携和成本低廉的微生物核酸分析系统。本研究是环境科学与生物医学研究院的交叉联合项目,通过环境生物学技术和微流控技术的结合,对环境微生物进行分析和检测,为环境科学的发展提供新的技术支持。另外,本研究所构建的微流控芯片系统在对环境中其它微生物的检测中也能发挥出独特的优势,具有较高的理论和应用价值。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：X835

【参考文献】