有机磷阻燃剂（TDCIPP）对人神经母瘤细胞的毒性效应及分子机制研究

发布时间：2020-05-04 12:22

【摘要】：有机磷阻燃剂是大量生产和使用的一类化学物质,主要作为溴代阻燃剂的替代品,在环境中广泛存在,属于新兴有机污染物。目前研究表明:磷酸三(1,3-二氯异丙基)酯(Phosphoric acid tris(1,3-dichloro-2-propyl),TDCIPP)具有致癌性、神经毒性、生殖毒性、生长发育毒性等毒性效应,但其对人神经母瘤细胞毒性效应的研究却鲜见报道,尤其是TDCIPP诱导神经细胞毒性作用的分子机理尚未深入开展。本论文采用体外染毒培养方式,深入探讨了 TDCIPP对人神经母瘤细胞(SH-SY5Y cell)的毒性作用及分子机制。本论文研究工作及主要研究结果包含以下几个方面:1.研究了 TDCIPP暴露对SH-SY5Y细胞的毒性效应。结果表明TDCIPP暴露于SH-SY5Y细胞的最大无效应浓度为2.5 μM,最低效应浓度为10 μM;TDCIPP在10-200 μM的浓度范围内显著降低细胞生存率且具有剂量和时间依赖性,TDCIPP作用24 h,SH-SY5Y细胞的半数致死剂量为100 μM。同时,TDCIPP诱导SH-SY5Y的细胞毒性也具有显著的时间依赖性,在TDCIPP(100 μM)处理24 h时,细胞生存率约为50%。2.研究了 TDCIPP诱导SH-SY5Y细胞凋亡。通过Hochect 33342染色发现TDCIPP导致SH-SY5Y细胞核形态发生变化,主要表现为核固缩和核破碎,用AnneixV FITC/PI双染进行细胞凋亡率测定发现TDCIPP暴露显著诱导SH-SY5Y细胞凋亡,且呈显著剂量依赖性;采用免疫印迹(Westernblot,WB)方法对凋亡执行的关键蛋白caspase 3/cleaved caspase 3进行定量检测,结果表明:TDCIPP显著增加SH-SY5Y细胞中caspase 3/cleaved caspase 3蛋白的表达并呈剂量依赖性。3.研究了 TDCIPP诱导SH-SY5Y细胞自吞噬及其相关分子机制,并揭示了自吞噬在TDCIPP诱导的SH-SY5Y细胞凋亡过程中的作用。结果发现:TDCIPP能诱导SH-SY5Y细胞自吞噬增强,主要表现在经TDCIPP处理后,SH-SY5Y细胞中自吞噬标志性蛋白一一微管相关蛋白轻链311(microtubule associated protein light chain 3)/LC3I的比值增加及p62/SQSTM1的降解增加;激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测发现:细胞内自噬小体数量显著增加。自吞噬抑制剂一一3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3MA)和氯喹(Chloroquine,CQ)通过抑制细胞内自吞噬的强度,显著增强TDCIPP诱导SH-SY5Y细胞凋亡,而自吞噬诱导剂一一雷帕霉素(Rapamycin,Rapa)则通过增强细胞内自吞噬导致TDCIPP诱导的SH-SY5Y细胞凋亡率显著降低,细胞存活率显著增加。以上结果表明:自吞噬在TDCIPP诱导的SH-SY5Y细胞凋亡中具有一定的保护作用。对TDCIPP诱导自吞噬信号通路的研究发现:活性氧(Reactive oxygen species,ROS)及腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine Monophosphate Activated Protein Kinase,AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Manmal target of rapamacy,mTOR)/Unc-51 激酶(Unc-51 kinase,ULK1)信号通路参与调解TDCIPP诱导的自吞噬,抗氧化剂vV-乙酰半胱氨酸(iV-acetylcysteine,NAC)能够有效拮抗TDCIPP诱导AMPK激活并增强自吞噬,并有效抑制TDCIPP诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。4.深入探讨了 TDCIPP诱导SH-SY5Y细胞凋亡的分子机制。结果发现:TDCIPP引起细胞内ROS及钙离子含量增加,线粒体膜电位降低。另外,TDCIPP导致内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)相关蛋白:真核转录起始因子(Eukaryotic translation initiation factor 2A,EIF2a),转录激活因子 4(Activating transcription factor,ATF4),葡萄糖调解蛋白(Gucose regulated protein,GRP78)及促凋亡因子 C/EBP 同源蛋白(proapoptotic factor C/EBP homologous protein,CHOP)白的表达量显著增加。内质网应激抑制剂苯基丁酸(phenyl butyric acid,PBA)能够显著抑制TDCIPP诱导的SH-SY5Y细胞内质网应急,并引起抑细胞凋亡基因bcl-2表达上调,促细胞凋亡基因bax表达下调,显著抑制TDCIPP诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。抗氧化剂NAC有效清除细胞内ROS并抑制内质网应激导致TDCIPP诱导SH-SY5Y细胞凋亡率降低。因此,TDCIPP诱导SH-SY5Y细胞凋亡通过ROS依赖的内质网应激及线粒体途径调节。5.研究了低剂量TDCIPP对SH-SY5Y细胞分化的作用,并对其分子机制进行深入探讨。结果表明:TDCIPP(0-2.5 μM)处理SH-SY5Y细胞5 d不会对SH-SY5Y细胞生存率产生显著影响。另外,TDCIPP(2.5 μM)能有效诱导SH-SY5Y细胞分化并具时间依赖性,主要表现为SH-SY5Y细胞神经突增长及含长轴突神经元比例增多。对TDCIPP诱导SH-SY5Y细胞分化作用的研究发现:自吞噬参与调节低剂量TDCIPP诱导的SH-SY5Y细胞分化,自吞噬抑制剂3MA通过抑制自吞噬显著减少含有长轴突神经元的数量,同时也显著缩短了分化神经元表面轴突的长度。细胞骨架蛋白:神经丝蛋白H(neurofilament-H,NF-H),NF-L及β-微管蛋白(β-tubullin)在TDCIPP诱导SH-SY5Y细胞分化过程中表达量显著上β调,自吞噬抑制剂3MA显著抑制TDCIPP诱导细胞骨架蛋白表达上调。以上研究结果表明,低剂量TDCIPP能有效诱导SH-SY5Y细胞分化,其分子机制与自吞噬调节的细胞骨架蛋白表达上调具显著相关性。
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１．１有机磷阻燃剂的特性逡逑１．１．１有机磷阻燃剂的理化性质逡逑ＯＰＦＲｓ是由磷酸基团的氢被取代而形成的一类化合物（图１－１），结构通式逡逑为（ＲＩＯ）邋（Ｒ２０）邋（Ｒ３０）邋Ｐ０。典型ＯＰＦＲｓ可分为三类，，分别是氯代类、烷逡逑基类和芳基类。磷酸酯化过程中醇类物质的性质决定了邋ＯＰＦＲｓ的物理化学性质。逡逑因此，不同ＯＰＦＲｓ的ＬｏｇＫｏｗ、水溶性等物理化学性质均存在很大差异性，表逡逑１－１列出了常见有机磷酸酯类阻燃剂和增塑剂的理化性质（李富华，２０１１）。逡逑０邋＾逡逑0邋ＩＩ邋0逡逑Ｒｉ邋ｐ邋Ｒ２逡逑ｉ逡逑０邋Ｄ逡逑Ｒ３逡逑图１－１有机磷酸酯的化学结构式逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＯＰＥｓ逡逑（１）

逡逑现浓度依赖性（图２－２）。通过计算得出ＴＤＣＩＰＰ相对于ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞的半数致逡逑死量（ＬＣ５0）约为１００邋ｐＭ。ＬＤＨ漏出实验结果也表明随着ＴＤＣＩＰＰ处理组浓度的逡逑增加，对ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞的毒性作用逐渐增加（图２－３），在ＴＤＣＩＰＰ邋（１００ｐＭ）逡逑处理不同的时间发现随着处理时间的增长，ＴＤＣＩＰＰ对ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞的毒性作逡逑用增加（图２－４）。由此得出，ＴＤＣＩＰＰ对ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞的细胞毒性呈显著的逡逑浓度和时间依赖性，此结果与ＭＴＴ实验结果一致。通过上述实验得出：相对于逡逑空白对照，当细胞毒性达到５０％时，ＴＤＣＩＰＰ浓度为１００邋ｐＭ，处理时间为２４邋ｈ。逡逑以上结果表明，对于ＴＤＣＩＰＰ对于ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞具有显著的细胞毒性作用。逡逑ＩＷＭ逡逑图２－１．不同浓度ＴＤＣＩＰＰ作用下ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞密度的变化（２４邋ｈ）逡逑Ｆｉｇ邋２－１．邋Ｃｈａｎｇｅ邋ｏｆ邋ｃｅｌｌ邋ｄｅｎｓｉｔｙ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｖａｒｉｏｕｓ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋ＴＤＣＩＰＰ邋（０邋？２００邋ｊｉＭ）邋ｆｏｒ邋２４邋ｈ逡逑？邋１２０－，逡逑？逦器凝兹逦＊＊逡逑Ｕ逦９０－逦Ｕｐ逦ｒ＾Ｆｐｉ逡逑＾逦Ｓ

本文编号：2648535