洋葱伯克霍尔德菌BNS对苯酚胁迫的分子响应及关键酶的异源表达

发布时间：2020-05-09 00:26

【摘要】：酚类污染物是现代化工业社会生产中的常见污染物之一,利用微生物对酚类污染物的降解是一种环境友好型的处理方法,微生物对酚类污染物胁迫的耐受机制一直是科研人员关注的焦点。研究不同微生物菌株对酚类化合物的耐受及生物降解机制,有利于对菌株进行耐受与降解策略的改造,对于开发新的有效的酚类污染物修复技术具有重要意义。本实验以筛选到的一株洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia BNS)为供试菌株,运用传统微生物实验方法考察了菌株的生长及降酚性能。构建洋葱伯克霍尔德菌BNS的苯酚胁迫体系,并利用转录组学技术和蛋白组学(Label-free)技术对苯酚胁迫0 h、2 h、12 h、24 h菌株的mRNA样品和蛋白样品进行测序分析,通过差异基因与差异蛋白的GO与pathway富集分析,阐明洋葱伯克霍尔德菌BNS应答苯酚胁迫的转录水平与蛋白水平的响应机制,并对胁迫及降解相关的关键酶进行了异源表达尝试,具体获得了如下结果:1.洋葱伯克霍尔德菌(B.cepacia BNS)具有较强的抗逆性能,在pH 4~10生长良好,80℃处理30 min,菌株仍然能够存活。菌株通过胞外木质素过氧化物酶和胞内漆酶对合成染料进行脱色,同时对苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、β-萘酚都具有降解作用,菌株对苯酚的最大耐受浓度为1.5 g/L,且在低浓度下可能通过羟化途径降解,在高浓度下可能通过羟化和羧化途径同时进行苯酚的代谢。2.利用mRNA-Seq对1.5 g/L苯酚胁迫下0 h、2 h、12 h、24 h的mRNA样品进行转录本测序,共得到7614个表达基因,5691个显著差异表达基因。通过差异基因的GO与Pathway富集分析发现,在胁迫初期菌株主要通过降低自身的代谢活性,提高EnvZ/OmpR、外排泵、ABC转运蛋白、DNA修复蛋白、超氧化物歧化酶SOD、冷激蛋白、谷胱甘肽GSH、漆酶等功能和应激基因的表达来增强对苯酚的耐受。胁迫中期碳源饥饿因子CST与苯酚代谢通路相关基因表达上调明显,外排泵、ABC转运蛋白等继续保持高表达状态,应激相关基因表达下调。在胁迫后期,菌株处于活跃生长状态,苯酚代谢速度加大,此阶段苯酚降解相关酶、氧化磷酸化、分子伴侣、外膜蛋白、降解蛋白等高水平表达。菌株在不同时刻通过调控通路基因的转录水平来应答苯酚的胁迫和毒害,并由初期的被动耐受转变为后期的主动降解,且主要通过β-酮己二酸途径对苯酚进行降解。3.对苯酚胁迫下菌株转录因子和小RNA(small RNA)的差异表达情况进行了分析。获得10个家族共计461个转录因子信息,并在转录水平发挥调控作用,其中LysR家族转录因子主要参与DNA损伤修复、苯酚耐受及苯酚的降解过程;AraC家族、TetR转录因子主要调控外排泵的表达、渗透压调控等作用;Sigma因子通过σ70家族基础转录调控因子和σ54家族调节碳氮代谢以及anti-sigma因子的作用来调控菌株对苯酚的耐受及降解;GntR家族主要调节菌体自身的生长代谢和膜相关蛋白的表达;MarR家族与胞内氧化应激的反应相关;IclR家族在原儿茶酚等芳香酚的降解调控方面具有重要作用;LuxR家族主要调控了菌株的群体感应、生物膜及毒力因子的表达;FnR家族与XylR家族蛋白调控了菌株的氧感应压力及有机物的代谢。另外还获得了484个sRNA的基因信息,在转录后水平调控1501个mRNA,形成了16760对sRNA-mRNA靶向调控关系。通过sRNA富集分析发现,sRNA的调控作用主要参与了运转RNA的乙酰化、甘油磷脂代谢、蛋白代谢与激活、磷脂酰肌醇代谢等生物过程。4.利用非标记定量蛋白组学(Label-free)技术对苯酚胁迫下的菌体蛋白表达差异进行鉴定分析,共鉴定出3194个蛋白信息,显著差异的蛋白有1104个,其中表达差异蛋白684个,有无差异蛋白420个。经过GO功能分析发现,差异表达蛋白的功能主要分布在催化活性,结合功能,转运活性,分子结构和转录调控,主要参与了代谢过程、细胞过程、细胞定位、苯甲酸降解、生物调控等重要生物学过程。菌株通过调控多种功能的膜蛋白、转录调控蛋白、应激响应蛋白的差异表达来提高对苯酚的耐受,通过调控苯酚β-酮己二酸途径中的ortho支路和原儿茶酚代谢支路来降解苯酚,以减少苯酚对细胞的毒性。5.构建了以pET32a为载体的原核表达体系,对洋葱伯克霍尔德菌BNS类漆酶进行了大肠杆菌表达,成功获得了一个分子量为30 kDa左右的目的蛋白,此蛋白以二聚体的形式发挥活性,纯化后以ABTS为底物的比活性为7.81 U/mg,Km和kcat分别为156.4μM和619.44 s~(-1),催化效率为3.96μM~(-1) s~(-1);以2,6-DMP为底物的比活性为12.3U/mg,Km和kcat分别为100.2μM和1162.22 s~(-1),催化效率为11.60μM~(-1) s~(-1),同时能对多种合成染料进行脱色。另外,利用毕赤酵母Ppic9K载体与GS115分泌表达系统对洋葱伯克霍尔德菌中儿茶酚1,2-双加氧酶(cat12)进行了分泌表达尝试,在胞外成功获得了一个分子量为35 kDa的蛋白,该蛋白以邻苯二酚为底物时的活性为22.55U/mg。
【图文】：

不动杆菌（Acinetobactersp.）在苯酚胁迫下的分子响应（Lin2017）

产乙醇细菌对抑制剂的耐受及适应机制（IbraheemandNdimba2013）
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X703
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本文编号：2655280