海洋硫氧化菌Thioclava分类鉴定及其硫氧化机制研究

发布时间：2020-05-13 18:44

【摘要】：随着我国经济社会快速发展,以硫化物/硫化氢为代表的硫污染日益严重。近些年,生物处理硫污染方法由于具有绿色、高效和经济等优点得到了广泛关注。但是,其应用目前存在两个突出问题:硫氧化菌株资源匮乏和硫氧化代谢机制认识不足。这不但无法满足不同类型硫污染处理需求,而且限制了有目的的条件优化和硫氧化菌的遗传改良。因此,获得更多高效的硫氧化菌并认识其硫氧化特性和代谢机制显得尤为重要。我们课题组前期研究表明:在海洋环境中广泛分布的硫膨大杆菌(Thioclava)具有较好的硫氧化能力,但是,其分类鉴定和硫氧化机制仍不清晰。因此,本文在Thioclava属细菌分类鉴定及其硫氧化途径等方面开展了研究,这将为后续硫氧化菌株资源的挖掘和工程应用提供理论基础。本文通过串联5个看家基因(顺序:gyrB、rpoD、dnaK、trpB和recA)建立了适用于Thioclava分类研究的多位点序列分析(multilocus sequence analysis,MLSA)方法。16S rRNA基因划分23株Thioclava菌为6个类群,但是其无法区分类群内菌株。相反,MLSA划分这些菌株为7个类群,其中3个为新类群,而且其能够精确区分类群内菌株。代表菌株基因组序列的数值DNA-DNA杂交(digital DNA-DNA hybridization,dDDH)和平均核苷酸相似性(average nucleotide identity,ANI)分析确认了MLSA结果,并发现9个种,其中5个为潜在新种。dDDH-MLSA和dDDH-ANI相关性分析表明:97.3%的MLSA相似度和96.07%的ANI都对应70%的dDDH种分类阈值,因此二者也可以作为种描述阈值。另外,rpoD基因可以作为Thioclava菌株快速分类的分子标记。本文利用多相分类学方法对3个潜在新种进行鉴定。3个新种代表的3个模式菌株革兰氏染色呈阴性,细胞呈短杆状,好氧,酶活特征相似,主要脂肪酸是Summed Feature 8,主要磷脂成分是磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和糖脂,呼吸醌是Q10,DNA G+C含量范围为63.8~64.1 mol%。3个模式菌株在菌落形态、细胞大小、鞭毛、酶活特征、脂肪酸含量等方面存在显著差异。16S rRNA基因分析、MLSA、dDDH和ANI等基因型特征也支持3个新种的建立。3个新种分别命名为Thioclava sediminum(沉积物硫膨大杆菌)、Thioclava nitratireducens(硝酸盐还原硫膨大杆菌)和Thioclava marina(海洋硫膨大杆菌),其对应模式菌株分别为MCCC1A10143~T、MCCC 1A07302~T和MCCC 1A03502~T。本文选择T.nitratireducens MCCC 1A07302~T作为代表进行硫氧化机制研究。在获得其基因组完成图情况下,通过BLAST、序列特征分析和系统发育分析,初步确定了其硫氧化相关基因,使用实时定量PCR和转录组测序方法对关键的硫氧化基因进行了验证,在此基础上构建了该菌株完整的硫氧化模型:Sqr负责氧化硫化物,SqrR负调控sqr基因转录;Pdo2(AQS46486.1)负责氧化单质硫生成亚硫酸盐,Rho负责催化甘肽过硫化物和亚硫酸盐反应生成硫代硫酸盐;碱性和中性条件下Sox多酶复合体负责氧化硫代硫酸盐为硫酸盐,酸性条件下Tsd负责氧化硫代硫酸盐为连四硫酸盐;Sox复合体或者新基因/酶负责亚硫酸盐氧化。硫氧化特性研究表明:菌株MCCC 1A07302~T是一株高效的硫氧化菌,其BMG03_15715代表蛋白负责硫代硫酸盐和亚硫酸盐转运。菌株MCCC 1A07302~T存在多种碳、氮和硫代谢途径以及完整电子传递途径。另外,菌株MCCC 1A07302~T硫氧化作用与同化硫酸盐还原、反硝化作用和电子传递关系密切。综上,本文对海洋Thioclava属菌株进行了系统地研究,完善了其分类体系,确定了其硫氧化特性和代谢途径,探索了其硫氧化过程和其它代谢途径的关联。因此,本文将为后续硫氧化调控机制的探索和硫氧化菌资源的开发利用提供理论依据。
【图文】：

硫酸盐还原,硫氧化,硫循环,有机硫

硫氧化；2，硫酸盐还原；3，同化硫酸盐还原；4异化硫酸盐还原） schematic diagram for sulfur cycle (1, sulfur oxidation; 2, sulte reduction; 4, mineralization of organic sulfur; 5, dissimilator细菌种类研究，是指将低价态具有还原性的硫化物或单质硫氧化合物的类群总称[50]。硫氧化菌种类多样，分布能监测和分离获得硫氧化菌，而海洋环境中的热年引起了更广泛关注。如上所示，海洋存在大量硫酸盐还原菌作为电子受体，通过硫酸盐还原作（图 1-1）。这些大量的还原性硫化合物不但为硫底物，而且也直接/间接促进了硫氧化菌种类的多 1-2 和表 1-2 所示，本章节将重点介绍目前研究较

硫氧化,系统发育树,终产物,菌株

图 1-2 硫氧化菌代表菌株 16S rRNA 基因序列系统发育树[57]he phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequences of the representative sbacteria[57]硫细菌（Purple nonsulfur bacteria，PNSB）主要包括 Alphaptobacteraceae、Bradyrhizobiaceae、Hyphomicrobiaceae、Rhodirillaceae 等科的菌株和 Betaproteobacteria 纲部分菌株[51]。/H2S 的能力有差异，，但总体而言，与 GSB 和 PSB 相比，P受性更低。因此，较低浓度的 H2S 即可抑制其生长。Betaperiales 目 Comamonadaceae 科中的菌株 Rubrivivax gelatino硫氧化多酶复合体（sulfur oxidation enzyme system，Sox），酸盐[52]。Alphaproteobacteria 纲中 PNSB 的硫氧化现象更加中的中间代谢物和终产物却因菌而异。大多数 PNSB 能够盐或者连四硫酸盐，少数终产物是单质硫。同时，与 GSB 和有氧的条件下（好氧或者微好氧）进行硫氧化。因此，相
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X701;X172

【参考文献】