赤潮生物的分子探针检测方法及其应用研究

发布时间：2020-05-17 00:06

【摘要】： 有害赤潮正成为越来越严重的全球性海洋灾害。本文针对目前赤潮藻分类鉴定和快速检测方法中的不足,从最基本的检测方法与技术的建立和优化入手,对赤潮生物分类、鉴定中的形态学、化学分类学和分子分类学问题以及赤潮生物原位增长率测定等基础性科学问题开展了研究,同时也在寡核苷酸、肽核酸和细胞凝集素3类探针的设计、筛选、验证、开发等方面开展了系列研究,建立和发展了上述3类探针的检测应用技术,并对这些探针进行了实验室验证和在现场样品的检测中进行了应用。本文的主要研究内容和结果包括以下几个方面: 1.建立了赤潮监测中样品采集处理、分离和纯化培养的技术体系;建立和优化了裸甲藻(Gymnodinium)扫描电镜观察技术和环境样品的扫描电镜观察方法;提出了库尔特计数是相对简便、快捷、准确、可行的细胞计数方法;应用基于反相高效液相色谱(HPLC)的光合色素分析技术及原位荧光激发光谱测定方法,得出不同类群浮游植物对不同的营养盐限制存在不同响应机制的结论;用荧光强度来监测浮游植物生理状态及营养状态变化具有一定的可行性,HPLC和原位荧光两种方法指示浮游植物的生理状态存在一定差异。 2.基于光合色素分析的化学分类方法能从光合色素组成和比例上区分一些赤潮藻的不同属、属下不同种甚至同种的不同地理株系,并可为进一步鉴定和细分这些赤潮生物提供重要的分类依据;用光合色素组成及其比值构建的聚类分析能较好地反映赤潮生物间的亲缘关系。用PCR产物分析的分子分类方法表明,基于18S rRNA序列检测分析的变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术分类精确度不高;rDNA序列分析相对可靠,尤其是针对转录间隔区(ITS)的长度和序列分析以及基于28S rRNA的D_1、D_2区序列分析,可以提供相对准确的分类信息,为设计分子探针提供了依据;AP-PCR是以基因组的差异分析为基础,所以其分类信息较为丰富和全面。基于ITS序列建立的系统进化树能显示Takayama pulchellum和相关属的亲缘关系;用核糖体大亚基序列建立的系统发育树可把Karlodinium属和Takayama属区分开,但不能很好地把环沟藻属(Gyrodinium)与其它藻区分开;用核糖体小亚基序列构建的系统进化树对近源种的分辩率较差。 3.根据核糖体大、小亚基的序列信息,针对中国厦门海域的微小原甲藻
【图文】：

分子分类,适用于,方法,分子探针

厦门大学博士学位论文侯建军：赤潮生物的分子探针检测方法及其应用研究amplified fingerprints ， DAF) 、随机扩增多态性 DNA(random amplifyingpolymorphism，RAPD)、扩增 rDNA 限制性酶切片断分析方法(amplified ribosomalDNA restriction analysis，，ARDRA)以及变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient geleletrophoresis，DGGE)等，这些分子分析技术广泛地被应用于对浮游植物进行生态学及分类学等研究(de Bruin et al.，2003；Qin et al.，2004；Groben et al.，2005)。但不同的分类方法适用于不同的分类水平(王爱杰等，2004)(图 1)。

原理图,寡核苷酸探针,原理图,目标

(Capture probe 和 Detection Probe)，以 96 孔平板和寡核苷酸基因玻璃芯片(Chips)为载体，采用直接荧光或化学发光的检测方式(CY3 染色或 APA 检测或 TSA 信号放大)(见图 1-2)。目前核酸检测的 Sandwich 杂交主要基于四种固相支持平台：1)磁珠；2)96 孔平板；3)玻片；4)膜。磁珠需要特定的磁分离仪器，而膜作为固相载体不适合长期保存。具体操作上，可将检测板、简易的细胞裂解液和杂交信号检测试剂结合在一起形成赤潮检测试剂盒，从而应用于赤潮海域现场的实际监测工作，根据具体效果与发现的问题可进一步完善检测试剂盒及操作程序(Scholin eal.，1996)。上述检测方法具有快速、简便的特点，并能实现高通量和自动化，不受检测环境的影响，对不同细胞周期的藻类甚至藻类的孢子也能直接进行检测(Bolch，2001)。但这类方法的弱点在于，检测中无法同时提供传统的形态学特征作为验证依据，同时检测信号、检测限和样品细胞数量关系的可靠性也值得进一步研究。
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：X55

【引证文献】