土壤杆菌31749合成热凝胶的氮调控机理及高产策略研究

发布时间：2020-05-17 12:07

【摘要】：本文以一株能大量合成胞外多糖热凝胶的土壤杆菌31749 (Agrobacterium sp. ATCC 31749)为研究对象,在初步了解土壤杆菌31749胞内碳源及氮源代谢的基础上,运用代谢工程和微生物生理学的理论与方法,就氮代谢双组分系统NtrB-NtrC调控土壤杆菌31749在氮源限制条件下合成胞外多糖的机理展开研究。主要研究结果如下: (1)采用RT-qPCR和2-DE技术研究了土壤杆菌31749氮源代谢调控系统和菌体总蛋白对氮源限制环境的应答变化。结果表明,氮源限制条件可以显著提高氮源代谢基因glnA、gltB、nifA及其相关调控基因ntrC、ntrB、ntrX、ntrY的相对转录水平,并将碳代谢流分配关键基因exoC的相对转录水平提高了14倍。蛋白质二维电泳分析发现,土壤杆菌31749在应答环境氮源含量变化时,14个蛋白质表达量显著提高,6个蛋白质表达量下调。这20个蛋白质中有4个被成功鉴定,分别为分子伴侣GroEL、未知蛋白Atu1730、ABC转运蛋白和烯酰ACP还原酶。ABC转运蛋白表达水平的提高满足菌体大量转移糖类物质的需求,烯酰ACP还原酶表达量的下调使菌体细胞壁合成受阻,而用于细胞壁合成的UDPG被主要用于热凝胶的合成。 (2)利用同源重组原理构建土壤杆菌31749的ntrC突变株ΔntrC,分析ΔntrC对氮源的应答和利用情况。结果表明:ΔntrC对培养基中NH_4Cl和硝酸钾的利用速度显著减慢,但能正常利用谷氨酸和谷氨酰胺。无论ΔntrC利用这4种氮源中的任何一种,热凝胶合成量均小于2.0 g/L。在以NH_4Cl为氮源的分批发酵过程中,ΔntrC的热凝胶合成时间相对野生菌延迟15 h,最终发酵液热凝胶含量为4.8 g/L,显著的低于野生菌热凝胶产量(25.7 g/L)。另外,ΔntrC在菌体形态变化速度上显著不同于野生菌,其形态在对数生长期几乎全是杆状。通过分析ΔntrC和野生菌在生长期的总蛋白表达差异,发现43个蛋白质表达量发生显著变化,22个表达上调,21个表达下调。43个蛋白质中有4个表达量变化显著的被成功鉴定,分别为钴胺素生物合成蛋白、肽基脯氨酰顺反异构酶、核苷二磷酸激酶和N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸脱氢酶。上述结果也证实最初假设,即NtrC参与调控热凝胶的合成。 (3)利用同源重组原理进一步构建土壤杆菌31749的ntrB突变株ΔntrB,并分析ΔntrB对环境氮源应答和利用情况。结果表明:ΔntrB对NH_4Cl的利用速度显著减慢,但能正常利用硝酸钾、谷氨酸和谷氨酰胺。以NH_4Cl为氮源的分批发酵过程中,ΔntrB氮源消耗时间延长5 h,但生物量对氮源得率(Y_(X/N))相比野生菌基本不变,仍维持在1.875 g/g的水平;而突变株ΔntrB合成热凝胶的能力显著削弱,热凝胶产量仅为10.9 g/L。ΔntrB的菌体形态变化速度也较野生菌加快,但是变化速度没有ΔntrC快。通过比较ΔntrC和ΔntrB特性发现,NtrB并不是唯一能对NtrC进行磷酸化的蛋白,可能存在其他的此类蛋白X,但是X蛋白对NtrC的磷酸化能力比NtrB低。 (4)ΔntrC和ΔntrB都开启一种新聚合物的合成。ΔntrC利用谷氨酸为氮源时所产新聚合物产量最高,达到6.5 g/L;ΔntrB以KNO_3为氮源时新聚合物产量只有2.6 g/L。ΔntrC和ΔntrB解除了氮源对新胞外聚合物合成的限制作用,在氮源充足条件下,二者都能合成新的胞外聚合物。新聚合物具有极强的吸水性,但不溶于水,也不溶解于NaOH、HCl和无水乙醇。红外光谱扫描结果发现,新聚合物的吸收峰与热凝胶标样的吸收峰大部分一致。样品在1000-1100 cm~(-1)和3480 cm~(-1)分别有很强的糖苷键和羟基的特征吸收;但是新聚合物不同于热凝胶是在890 cm~(-1)处没有明显的β 构型的特征吸收峰。单糖组成分析发现,新聚合物由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和其余一种未知的单糖组成。 (5)通过添加高能化合物为土壤杆菌31749合成热凝胶提供能量以提高胞外多糖产量。首先确定了土壤杆菌31749染色体基因组上存在多聚磷酸激酶和外切聚磷酸酶,其中多聚磷酸激酶编码基因ppk序列与Agrobacterium tumefaciens. C58的同源基因有95%的一致性,而外切聚磷酸激酶编码基因ppx与Rhizobium sp. NGR234染色体上此基因有86%的一致性。利用3种具有不同高能磷酸键的低聚磷酸盐Na_4P_2O_7、Na_5P_3O_(10)和(NaPO_3)_6取代培养基中的KH_2PO_4-K_2HPO_4,将它们作为高能磷酸键供体和磷元素营养添加到热凝胶发酵体系中。结果表明:在培养基中分别添加0.024 mol/L的Na_5P_3O_(10)和0.048 mol/L的(NaPO_3)_6,对应的热凝胶产量较对照分别提高了23%和134%,而副产物乙酸较对照分别降低87.5%和77.7%,表明低聚磷酸盐的添加促进了细胞代谢过程的能量供给,在缓减副产物积累的同时又强化了热凝胶的合成。当除去上述发酵体系中的CaCO_3,添加上述3种低聚磷酸盐时,生物量显著降低,几乎不合成热凝胶,发酵液pH最低降到2.1。当同时以CaCO_3和KH_2PO_4-K_2HPO_4作为缓冲物质,分别添加0.024 mol/L的Na_5P_3O_(10)和0.048 mol/L的(NaPO_3)_6发酵时,热凝胶产量变化不显著。但是,当发酵液不存在CaCO_3,只有KH_2PO_4-K_2HPO_4作为缓冲物质时,添加0.024 mol/L和0.048 mol/L的(NaPO_3)_6将使热凝胶分别达到18.4 g/L和16.9 g/L,较对照分别提高60.4%和49.4%。
【图文】：

效果图,细菌氮,固氮酶,编码基因

1.2.4 氮代谢双组分系统 NtrB-NtrC 研究进展(1) 对细菌固氮酶编码基因和氮源代谢能力的调控NtrB-NtrC 系统主要作用于氮源代谢的调控，如对细菌固氮酶的调控。细菌固氮酶编码基因簇包括 nod、nif 和 fix。固氮酶 Nif 编码基因 nif 和 Fix 编码基因 fix 受特异激活蛋白 NifA 的正调控[ 49 ]。Hill 等研究发现克雷伯氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)的 nifL 基因转录受氮代谢双组分系统 NtrB-NtrC 的调控，而 nifL 的表达产物 NifL 蛋白调控 NifA 对环境中的氮源和分子氧水平做出应答[50, 51]，，表明NtrB-NtrC 系统通过调控 K. pneumoniae 中 NifA 蛋白的表达而调控菌体多种固氮酶的活性。He 等也研究发现，K. pneumonia 的 ntrC 突变株没有 NifL 蛋白活性，不能使NifA 激活固氮酶编码基因 nif 和 fix 的转录和表达，菌体不能对环境中氮源的含量及种类变化做出应答。其它研究结果也表明 NtrC 激活了一些基因的转录，而这些基因的编码产物在氮源限制条件下激活了 NifL，NifL 进一步激活 NifA 而形成一个调控链，使很多固氮酶得以表达，达到固氮效果[52]，如图 1-3 所示。

凝胶电泳,土壤杆菌,转录水平,百盛

图 2-2 土壤杆菌 31749 的 RNA 凝胶电泳图rophoretogram of RNA from Agrobacterium stracted from sample at 36h; B is the RNA extrRμg)在反转录前加 2 units 的 DNasd cDNA Synthesis Kit 试剂盒所附程序-qPCR 进行分析，以 16S rRNA 作为内度大约 20 个碱基，退火温度为 60℃bp 之间，由赛百盛上海有限公司合成。R Green) QPK-201 (Toyobo, Osaka, Ja个样本做 3 个平行，相对转录水平采转录水平的变化以其在氮源充足时及质谱鉴定实验方法
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：X172

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