电化学活性细菌胞外电子转移的分子机制和调控方法

发布时间：2020-05-17 16:10

【摘要】：电化学活性细菌(electrochemically active bacteria,EAB)是自然界中一大类可进行胞外呼吸的微生物,能够代谢并转化环境中的污染物。在该过程中,EAB特有的胞外电子转移发挥了重要作用,因而可以利用该功能构建生物电化学系统,同时实现污染物降解和能源转化。目前,关于胞外电子转移的研究倾向于关注胞外电子传递通道的解析,但对于生物电化学系统中的决速步骤,EAB和胞外电子受体界面的相互作用以及电子转移机制仍然缺乏清晰的认识,而该界面缓慢的电子转移速率实际上是限制生物电化学系统走向应用的瓶颈。本论文针对EAB外膜蛋白/电子受体界面电子转移受限这一关键问题,系统性地探索了外膜蛋白与电子受体的界面电子传递机制,提出并验证了细菌胞内代谢和胞外界面修饰两种调控方式,实现了胞外电子转移能力的强化,提高了生物电化学系统污染物转化与能量转换的的性能。本论文的主要研究内容和结果如下:1.外膜蛋白OmcA与电子受体氧化石墨烯(graphene oxide,GO)的界面电子传递机理。OmcA是EAB模式菌株Shewanella的主要外膜蛋白之一,而GO可作为生物电化学系统阳极材料石墨烯的前驱。将提纯的OmcA与GO构建成一个电子转移体系,并通过电化学耦合多种谱学的方法对该生物与非生物界面的电子跨越进行了实时监测,探索了生物体系OmcA与化学体系GO在体外的相互作用机制和直接电子传递过程;SDS-PAGE和光谱表征结果证实得到了纯度高且具有活性的OmcA;蛋白膜循环伏安法以及驻流光谱动力学的分析,表明在胞外能够实现OmcA到GO的电子转移,且反应动力学符合米氏方程,表现出酶促反应的特征;通过圆二色谱和二维红外相关分析,在分子水平上揭示了 OmcA在GO表面的取向及之间的电子转移机理,发现OmcA的氨基与GO首先形成氢键,缩短了两者之间的距离,并伴随着OmcA二级结构的轻微变化;OmcA主要通过酰胺I键与GO发生作用,进一步改变了电子转移活性中心与GO的距离,从而实现了电子传递速率的提高。这些结果有助于理解废弃物能源化的胞外电子转移机制,为构建高效的生物电化学系统提供设计思路。2.OmcA与纳米Fe203的界面电子传递机制。EAB又被称为异化金属还原菌(dissimilatory metal-reducing bacteria,DMRB),可以与自然界铁、锰的氧化物进行电子转移,而外膜蛋白协同金属氧化物可通过改变活性中心的微观环境来影响EAB在环境生物修复中的作用。选取了土壤和沉积物中丰富的电子受体赤铁矿(α-Fe203)作为研究对象进行OmcA与Fe2O3界面电子传递机制的解析。红外光谱分析结果表明,α-Fe203对OmcA具有良好的亲和力,并促使活性中心血红素更加暴露于蛋白表面,进而使细胞色素c表现出更高的反应活性;二维相关光谱分析结果表明,蛋白表面的氨基酸(Thr725,Pro726和Ser727)与α-Fe2O3表面形成氢键引起的结构变化缩短了血红素活性中心铁原子与Fe2O3之间的距离;分子动力学模拟进一步提供了蛋白表面氨基酸在Fe2O3晶面的取向和界面处分子水平的结构信息,以及活性中心至金属氧化物界面的有效电子转移距离分布。这些结果证明电活性微生物-无机金属氧化物的协同作用,可能有利于发挥EAB在环境生物修复和生物能源转换中的作用。3.解偶联剂 3,3',4',5-四氯水杨酰苯胺(tetrachlorosalicylanilide,TCS)对Shewanella胞外电子传递的调控。EAB进行胞内代谢、维持生长是其胞外电子转移的前提,环境中存在的解偶联剂为调控EAB的能量代谢和胞外电子转移提供了可能。通过考察不同浓度解偶联剂TCS对微生物燃料电池产电和阳极底物消耗速率的影响,发现50 μg/l的TCS促进了Shewanell 对乳酸的消耗并提高了其产电能力,而400μg/l的TCS却抑制了Shewanella的代谢和产电。据此提出了低浓度TCS改变细胞代谢促进电子传递的多种方案,包括抑制质子动力势、促进电子和质子的泵出,改变代谢途径,抑制氧化磷酸化途径,细胞被迫通过发酵途径代谢底物等。研究结果表明,高浓度的TCS会降低ATP合成酶的活性,抑制细胞的活性和产电。这些结果表明,解偶联剂的适当添加能够为EAB的胞外电子转移提供一种简便的调控手段。4.内源性氧化还原媒介分子核黄素(riboflavin,RF)修饰的碳电极对EAB胞外电子传递过程的调控。除了通过胞内代谢调控电子传递以外,胞外电子受体的界面修饰也是有效的调控手段。通过电化学手段将内源性氧化还原媒介分子RF修饰在石墨烯基底表面,不仅增加电极表面的亲水性,而且阻抗谱结果也显示RF修饰后显著降低了电荷转移电阻;将修饰电极组装为微生物电解池和微生物燃料电池的运行结果表明,RF修饰提高了生物电化学系统的产电能力与稳定性;通过生物膜的电化学表征和分子模拟,发现氧化还原媒介修饰的碳基阳极,能够在分子水平上调节电极表面的电化学和物理性质;氧化还原媒介有机小分子在电化学活性蛋白与无机材料电极之间的“分子桥梁”作用,加速了电子穿梭,改进了电极材料的生物相容性,促进了生物膜生长,从而提高了能量转换效率,这为研发下一代生物电化学系统提供了新的思路。
【图文】：

逦第一章文献综述逦逡逑染元素的迁移转化以及重金属污染区域的生物修复有着重要影响。由于ＥＡＢ需逡逑要以有机底物作为电子供体和碳源，因而也同时参与了邋Ｃ、０、Ｎ等元素的地球逡逑化学循环。在有机污染物的生物降解方面，Ｇ．逦而ｃｅｍ能有效氧化酚类ｆ２１ｌ逡逑细菌则可有效降解偶氮染料和蒽醌等［１５］。逡逑１．２．２电化学活性细菌的胞外电子转移机理逡逑经典电子传递链是由一些列位于细胞质膜上，氧化还原电势从低到高排列的逡逑电子传递体组成，主要位于胞内。对于ＥＡＢ，，其电子传递链不仅包括从内膜到外逡逑膜的胞内电子传递链，而且更重要的是有一组甚至多组可实现电子从外膜到最终逡逑电子受体的胞外传递链。逡逑邋逦逦逦？？…？？……………逡逑

逑氢酶完成跨膜泵出，在内膜两侧形成质子梯度，膜外高浓度质子通过ＡＴＰ合成逡逑酶回流，释放能量，驱动ＡＴＰ合成，具体过程如图１－ｌｄ所示。这一过程称为氧逡逑化磷酸化，耦合了电子传递过程和ＡＴＰ合成过程［２８］。逡逑ＣＡＲＢＯＮ邋ＣＬＯＴＨ邋ＣＡＲＢＯＮ邋ＢＲＵＳＨ邋ＣＡＲＢＯＮ邋ＲＯＤ邋ＣＡＲＢＯＮ邋ＭＥＳＨ邋ＣＡＲＢＯＮ邋ＶＥＩＬ逡逑＿数｜１＿＿逡逑ＣＡＲＢＯＮ邋ＰＡＰＥＲ邋ＣＡＲＢＯＮ邋ＦＥＬＴ邋ＧＲＡＮＵＬＡＲ逦ＧＲＡＮＵＬＡＲ逦ＣＡＲＢＯＮＩＺＥＤ逡逑ＡＣＴＩＶＡＴＥＤ逦ＧＲＡＰＨＩＴＥ逦ＣＡＲＤＢＯＡＲＤ逡逑灥灥逡逑图１－２常见碳基底材料相片图［２９］。（ａ）碳布，（ｂ）碳刷，（ｃ）碳棒，（ｄ）碳网，（ｅ）碳纱，（ｆ）逡逑碳纸，（ｇ）碳毯，（ｈ）颗粒活性碳，（ｉ）石墨粒，（ｊ）碳纸板逡逑表１－２石墨烯和碳纳米管等碳基阳极材料逡逑阳极碳材料逦特性逦最大功率密度逡逑石墨烯泡沫［３Ｇ］逦高导电性，高表面积逦７８６ｍＷ／ｍ２逡逑碳纳米管海绵［３〖］逦３Ｄ骨架，低内阻等逦１８２邋Ｗ／ｍ３逡逑３Ｄ石墨烯泡沫镍［３２］逦高比表面积，均一的逦６６］邋Ｗ／ｍ３逡逑大孔隙骨架逡逑多壁碳纳米管／壳聚糖［３３］逦３Ｄ微通道结构逦２８７０邋ｍＷ／ｍ２逡逑壳聚糖／真空剥离石墨烯［３４］生物相容性，分层孔逦１５３０邋ｍＷ／ｍ２逡逑结构逡逑石墨烯海绵／不锈钢［３５］逦低成本逦１５７０邋ｍＷ／ｍ２逡逑碳纳米管纤维［３６］逦高导电
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X172;TM911.45

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本文编号：2668827