RAD50介导的DNA损伤应答在PM2.5诱导气道炎症中分子调控机制的研究

发布时间：2020-05-21 21:40

【摘要】：DNA损伤应答(DDR)是多细胞生物应对各种外源性刺激如紫外线、电离辐射、抗肿瘤药物及内源性生理性过程如DNA复制、转录所产生的代谢产物的重要病理生理过程。DDR是多级结构的信号传导途径,包括sensors,mediators,transducers和effectors。损伤应答的结局事件表现为以下情况:细胞周期停滞,受损伤的DNA分子被修复;受损DNA未能正确修复导致细胞凋亡;受损DNA未能正确修复而进入子一代细胞,导致基因组不稳定性,进而促进肿瘤的形成。目前已有很多证据证明DNA损伤应答广泛地参与了肺部疾病包括哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺癌、急性肺损伤等的病理生理过程。炎症是多细胞有机体针对对微生物及各种物理化学性伤害引起的免疫系统的最终反应。呼吸系统疾病的病理基础即是各种类型的急、慢性气道炎症。哮喘作为一种过敏性疾病,是由多种效应细胞如嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞参与的慢性气道炎症,同时由细胞因子、趋化因子、组胺和白三烯等组成的Th2型免疫反应复杂网络所调控。慢性阻塞性肺疾病的基本病理特征是由中性粒细胞、肺泡巨噬细胞及其相关的细胞因子如IL8、LTB4及蛋白酶如基质金属蛋白酶、弹性蛋白酶等长期作用形成肺气肿和慢性支气管炎。各种病原微生物(如LPS、细菌)、大气颗粒物(PM)、物理损伤等引起的急性肺损伤则是中性粒细胞浸润为主的Thl型炎症。MRE11-RAD50-NBS1(MRN)蛋白复合体作为DDRsensor,在维持基因组稳定性方面扮演着多重角色,包括修复DNA双链断裂(DSBs),检查点活化,减数分裂期期染色体重组和端粒长度维持等。以往的研究证实MRN复合体与肿瘤发生发展关系密切。MRN复合体中RAD50的亚等位基因突变有利于肿瘤的形成。而RAD50的靶向治疗增强了肺部鳞状细胞癌对铂类为基础的化疗方案的敏感性,这使得对于MRN复合体的研究由以往的结构和功能探索向临床应用转化。而最近的研究证实MRN复合体在炎症调控中也发挥着重要作用。MRE11和RAD50通过调节STING的运输过程来诱导I型干扰素的表达。树突状细胞(DC)转染DNA病毒后,MRN复合体从细胞核转移到细胞质,形成RAD50依赖性的Rad50-CARD9-dsDNA复合体,然后激活NF-κB和促进IL-lb产生,而RAD50条件性敲除的DC中,DNA转染后诱导的I型干扰素产生明显受到抑制。NBS1作为MRN复合体的一个蛋白亚基,对巨噬细胞正常衰老过程有着重要作用,巨噬细胞NBS1缺失后导致2,4-二硝基苯(DNFB)诱导的炎症反应明显增强。DNA损伤修复应答相关信号通路和炎症免疫反应两种重要机制在疾病过程中互相调控,影响疾病的最终结局。然而以往关于DNA损伤应答和固有免疫系统之间的互调机制均来源于病毒、细菌、DNA复制过程代谢产物等经典的刺激。PM2.5作为公众健康的严重危害因素,是一个成分复杂的混合物,那么PM2.5诱导的DNA损伤应答能否调控炎症反应?同时气道上皮细胞和巨噬细胞作为PM2.5诱导的肺部炎症中两种主要的效应细胞,发挥着至关重要的功能。然而在PM2.5诱导下的气道上皮细胞和巨噬细胞DNA损伤应答在炎症反应过程中的作用及分子调控机制尚未明确。因此,我们利用PM2.5在体内、体外同时干预气道上皮和巨噬细胞来研究RAD50介导的DNA损伤应答在PM2.5诱导的急性炎症中调控作用和具体机制,为PM2.5诱导的呼吸系统疾病急性加重提供潜在的治疗靶点。第一部分:巨噬细胞中RAD50介导的DNA损伤应答在PM2.5诱导的气道炎症中分子调控机制的研究目的:建立PM2.5干预巨噬细胞的体外感染模型和诱导小鼠肺部炎症的动物感染模型,探索巨噬细胞中DNA损伤应答在PM2.5诱导的肺部炎症中的作用及其相关调控机制。方法:体外PM干预小鼠骨髓来源的巨噬细胞和腹腔巨噬细胞,采用cometassay:检测DNA断裂,Q-PCR和ELISA法检测巨噬细胞及其上清中炎症因子的变化;采用Western Blot和免疫荧光检测巨噬细胞中DNA损伤应答信号通路、自噬通路、cGAS-STING以及NF-κB信号通路中相关蛋白的表达。体内,将8周龄的RAD50髓系特异性敲除的小鼠RAD50f/fLysmcre作为KO实验组,同窝生的小鼠RAD50f/f作为对照组,共分为4组,即对照NS组、对照PM组,KO-NS和KO-PM组。对照NS组和KO-NS组经气道滴注NS(50μl),相应的模型组气道滴注PM2.5(100μg/50μl)。观察并测定各组小鼠肺灌洗液中的细胞总数和白细胞分类计数、肺组织病理学的改变;采用ELISA法检测BALF中炎症因子的表达,采用Q-PCR法测定肺组织中的炎症因子的表达。结果:我们发现PM2.5在体外和体内均能诱导了显著的DNA损伤,同时引发了以核RPA,53BP1和γH2AX Foci点形成为代表的快速DNA损伤应答。基因敲除或者利用抑制剂功能性抑制DNA损伤应答传感器MRN复合物,均能导致巨噬细胞中PM2.5引起的包括Cxcl1,Cxcl2和Ifn-γ的细胞因子的产生增加。与在体外观察到的结果相似,具有髓系特异性敲除RAD50的小鼠显示出较对照组更高水平的气道炎症,表明在炎症期间DNA损伤应答的保护作用。PM干预RAD50缺失的BMDM后,其NF-κB表达较对照模型组明显增加,而小分子抑制剂抑制NF-κB后炎症得到缓解。结论:1.体内外模型中PM2.5均能诱导巨噬细胞DNA链断裂及相应的DNA损伤应答;2.DNA损伤应答sensor缺失导致大量堆积的未修复的损伤DNA,加重了PM诱导的气道炎症反应,而且这种调控作用可能是通过cGAS-NF-κB信号通路来实现的;3.DDR通路可能为PM2.5诱导的肺部疾病急性加重提供新的治疗靶点。第二部分:上皮细胞中RAD50介导的DNA损伤应答在PM2.5诱导的气道炎症中分子调控机制的初步研究目的:建立PM2.5干预气道上皮细胞的体外感染模型和诱导小鼠肺部炎症的动物感染模型,初步探索气道上皮细胞中DNA损伤应答在PM2.5诱导的肺部炎症中的作用。方法:体外PM干预气道上皮细胞HBE和Beas2B,采用comet assay检测DNA断裂,Q-PCR和ELISA法检测气道上皮细胞及其上清中炎症因子的变化;采用Western Blot和免疫荧光检测巨噬细胞中DNA损伤应答信号通路相关蛋白的表达。体内,利用6-8周龄的C57雄鼠,予MRE11抑制剂mirin气道滴注2小时后,PM干预。观察并测定各组小鼠肺灌洗液中的细胞总数和白细胞分类计数、肺组织病理学的改变,并采用Q-PCR法测定肺组织中的炎症因子的表达。结果:我们发现PM2.5在体外能诱导气道上皮细胞显著的DNA损伤,同时启动以核γH2AX Foci点形成为代表的快速DNA损伤应答。利用mirin抑制DNA损伤应答传感器MRN复合物,对气道上皮细胞中PM2.5引起的IL6,IL8和MUC5AC具有明显的保护作用。与在体外观察到的结果相似,体内mirin干预后对PM诱导的气道炎症具有明显的保护作用。结论:1.PM能诱导气道上皮细胞DNA损伤,并启动DNA损伤应答;2.气道上皮细胞DDR sensor功能抑制可缓解PM引起的炎症反应;
【图文】：

链断裂,肺泡巨噬细胞,小鼠

图１．３．１．１短期ＰＭ干预诱导的小鼠肺泡巨噬细胞ＤＮＡ链断裂。（Ａ）体内ＰＭ暴逡逑露不同时间后小鼠ＢＡＬＦ细胞总数结果。（Ｂ）体内ＰＭ干预不同时间后小鼠ＢＡＬＦ逡逑中性粒细胞比例。（Ｃ）邋ＰＭ干预２天的小鼠肺组织ＴＵＮＥＬ染色结果，绿色的ｆｏｃｉ逡逑点表示ＤＮＡ双链断裂位点，蓝色代表细胞核。（Ｄ）邋ＴＵＮＥＬ染色结果的定量分析。逡逑（Ｅ）肺泡巨噬细胞中ＤＮＡ链断裂，红色荧光表示巨噬细胞表面标记，绿色的ｆｏｃｉ逡逑点表示ＤＮＡ双链断裂位点，蓝色代表细胞核。（＊＊Ｐ＜０．０１，邋ＮＳ：邋Ｎｏｔ邋Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）逡逑２７逡逑

链断裂,诱导体,巨噬细胞,培养的

浙江大学博士学位论文逦实验结果逡逑１．３．１．２邋ＰＭ诱导体外培养的巨噬细胞ＤＮＡ链断裂逡逑为了进一步体外验证试验结果，我们提取了邋Ｃ５７／ＢＬ６小鼠的骨髓细胞，体外逡逑诱导分化成巨噬细胞（见方法学部分１．２．４．２）后，予ＰＭ１００ｕｇ／ｍＬ干预不同时间逡逑（３ｈ，６ｈ，邋１２ｈ，，邋２４ｈ）后，利用彗星实验检测巨噬细胞ＤＮＡ损伤程度，结果显示：逡逑在体外，ＰＭ颗粒可以诱导巨噬细胞ＤＮＡ链断裂，且随着时间延长，损伤有加重逡逑趋势（图邋１．３．１．２Ａ，邋Ｃ）。逡逑
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R56;X513

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