菌株Paracoccus versutus M-1降解酰胺类和有机磷类农药的关键酶基因的克隆和酶学研究

发布时间：2020-05-25 06:24

【摘要】：化学农药在农业生产中的作用不可替代,而农药残留污染的危害也日趋严重,这是人类亟需解决的一对矛盾。微生物原位修复被认为是解决这一矛盾的有效手段,相关的理论和应用研究方兴未艾。农药污染通常是涉及多种农药的混合污染,所以,相对于单一性降解菌株,具有广谱降解性能的菌株在农药污染修复中更有实际的应用价值;同时,农药残留微生物降解分子机制的阐明也将为微生物修复提供理论指导。 在前期的工作中,本实验室分离了一株广谱农药降解菌Paracoccus versutus M-1。菌株M-1能够降解有机磷杀虫剂久效磷、敌敌畏、磷胺和酰胺类除草剂敌稗、乙草胺、丁草胺。该菌株及其开发的菌剂已申请了国家专利保护,并在应用中发挥了重要作用。本研究以菌株M-1为研究材料,试图揭示其降解不同种农药残留的分子机制,以期为其应用提供理论参考。 1.菌株M-1的降解谱 M-1底物降解谱测定显示,除了上述底物外,M-1还能降解有机磷杀虫剂甲基对硫磷、甲基对氧磷和酰胺类化工中间体丙烯酰胺、苯甲酰胺、苯乙酰胺。在温度30℃,pH7.5,装液量为100/250mL,和1%接种量的加富培养基中,48小时,M-1对50ppm的甲基对硫磷和甲基对氧磷的降解效率分别为87.2%和93.4%。在温度30℃,pH7.5,装液量为100/250mL,和1%接种量的无机盐培养基中,12小时,M-1对100ppm的丙烯酰胺、苯甲酰胺和苯乙酰胺的降解效率分别为96.3%、94.1%和89.20%. 2.敌稗水解酶基因的克隆及酶学研究 通过菌株在含敌稗的LB平板上产生水解圈的现象作为筛选标记,鸟枪法构建菌株Paracoccus sp.Ml基因组文库。克隆出一个新的酰胺水解酶的基因pamh,该ORF大小为1434bp,编码477个氨基酸,在起始密码子ATG的上游5bp处有一可能的核糖体结合位点(AGGAGA), pamh的G+C含量为49.30%。pamh基因序列的Blast比对显示,在氨基酸水平上与已鉴定的酰胺酶最高同源性为31%。活力位点分析发现PamH具有酰胺酶特征家族的保守的Lys-Ser-Ser催化中心,将这三个位点分别突变为丙氨酸后,PamH均丧失活力。因此确定PamH是属于酰胺酶特征家族的一个新成员。 优化了PamH在E. coli BL21中最佳表达条件：以LBP培养菌株,装液量为150/500ml,置于摇床200rpm/min,菌体长到OD600=1.0时加入终浓度为0.005-0.01mM的IPTG,18-25℃,诱导表达8-10小时。其表达量比正常发酵时提高了20至30倍。经过纯化获得单一的PamH,大小约为52KDa,与预测的分子量52,390Da相一致。等电点(pI)为5.13。 PamH在45℃以下和pH5.0～10.0时比较稳定,PamH水解敌稗的最适温度为40℃,最适pH为8.0。大部分金属离子对PamH活力无影响,Hg2+, Co2+和Cu2+严重抑PamH的活力,而加入1mM的Mn2+和Mg2+对PamH的活力分别增强10%和30%。10mM的EDTA和1,10-菲罗啉对PamH活力无影响,说明PamH催化活力不需要金属辅助因子。丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF则强烈抑制该酶的活力。巯基试剂pCMB和碘乙酰胺(1mM)以及表面活力剂SDS, Tween-80, Triton X-100(10mM)抑制PamH40-70%的活力。 PamH对大部分芳香族和短链脂肪族的酰胺化合物水解活力较高,如,乙酰胺,丙酰胺,苯甲酰胺和苯乙酰胺。苯甲酰胺苯环上一个或两个C被N取代后,Pam对其水解活力明显降低,如,PamH对尼克酰胺和吡嗪酰胺的催化活力比苯甲酰胺分别降低了43%和49%。在本实验条件下,1mg的PamH在1min内可以水解丙烯酰胺产生14.33μM丙烯酸,丙烯酸是生产聚合物的重要的工业原料。PamH还对部分氨基酸类的酰胺底物(天冬酰胺,丙氨酰胺和谷氨酰胺)和尿素有微弱的活力,而对长链脂肪族酰胺化合物正己酰胺未检测到活力。PamH对敌稗的Km和Kcat分别是158μM和2.8s-1,在最佳反应条件下的催化效率值为0.018μM-1·s-1。而其它被尝试的敌稗类似结构的酰胺化合物均不能被其水解,包括乙草胺,丁草胺,对硝基乙酰苯胺和对氯乙酰苯胺。 PamH还具有酰基转移活力,以反应生成1mM甲基异羟肟酸为100%酶活。PamH对甲酰胺和异丁酰胺具有很强的转移能力相对活性分别为139%和178%。此外,PamH对芳基酰基酰胺化合物同样具有酰基转移酶活力,其对敌稗和对硝基乙酰苯胺的酰基转移相对活性分别为34%和79%。 3.有机磷水解酶基因的克隆及酶学研究 通过鸟枪法构建菌株Paracoccus sp.M1基因组文库,获得一个β-内酰胺酶家族的甲基对氧磷水解酶基因mpdp, ORF大小为975bp,编码324个氨基酸。mpdp基因序列的Blast比对显示,在氨基酸水平上与已鉴定蛋白最高同源性为38%；与Pseudomonas sp Wbc-3中的甲基对硫磷水解酶MPH同源性为33%。并且Mpdp的序列中具有甲基对硫磷水解酶的保守序列His-X-His-X-Asp-His,因此确定Mpdp是属于β-内酰胺金属酶家族的一个新蛋白。 Mpdp的底物谱较窄,仅对甲基对氧磷、甲基对硫磷和乙基对氧磷有催化活力。Mpdp水解甲基对氧磷Km和kcat值分别为286μM和14.8s-1。在最佳反应条件下的催化效率值为0.052min-1μM-1。 通过易错PCR获得了5个活力提高的突变子,其中活力最高的Mpp1对甲基对氧磷、乙基对氧磷和甲基对硫磷的比酶活分别为81.4、5.8、0.72U/mg比原始酶活分别提高了11.2、7.1、4.5倍。在单位点突变中K160R、K176R和A276V的kcat/Km比原始Mpdp分别提高了2.3、10和4.5倍,而同时含有这三个突变位点的Mppl对甲基对氧磷的动力学参数kcat和kcat/Km比原始Mpdp分别提高9倍和24.5倍。
【图文】：

生长代谢过程中产生二甲基硫代a愃帷⒀窍�酸盐和苯酷类物质的代谢中间产物。根据结果分析推测甲基对硫a惤到馔揪度缤，

本文编号：2679711