利用细胞表面展示技术去除典型环境污染物的研究及应用

发布时间：2020-05-27 03:10

【摘要】：环境污染问题变的日益突出,尤其是重金属和抗生素这两大环境污染物无处不在,汞是毒性最大的金属污染物之一,在环境中最常见的有两种形式,即无机汞和有机汞,其中无机汞所占的比例较大;但是,有机汞是汞最毒的一种存在形式,具有神经毒性,对人类造成不可逆转的危害;甲基汞是最常见的有机汞,人类摄入的甲基汞主要来自于鱼类的消费,鱼体内94%以上的汞是以甲基汞的形式存在,而且人体摄入的甲基汞会长期积累在体内。此外,抗生素是一种新型的环境污染物,我国是一个抗生素生产和使用量最大的国家,其中大部分的抗生素应用于畜禽养殖行业。人和动物服用的抗生素大部分(50%~90%)不能被完全吸收和代谢,导致大量的抗生素以原始形式随排泄物排放到环境中,对人类的健康造成巨大的威胁。而且牲畜粪便中残留的抗生素会抑制厌氧发酵过程中的甲烷生产。本文利用细胞表面展示技术对汞和抗生素的污染进行微生物修复,并将微生物的修复技术初步应用于这些污染物的治理。主要研究内容如下:1.浮游植物中所含的汞大多数为无机汞,进入食物链以后会不断的富集放大。文中将无机汞结合多肽通过冰晶核蛋白的锚定作用展示在大肠杆菌细胞表面获得工程菌株,发现工程菌株在不同金属离子溶液中可以选择性的吸附无机汞,对无机汞的最大吸附能力可达394.9μmol/g细菌干重。与对照细胞相比,无机汞的吸附能力提高了4倍,能去除约95%的无机汞。以可食用的鲫鱼作为研究模型,工程菌株投喂给鲫鱼并在鲫鱼肠道内定植,发现定植在鱼肠道内的工程菌株可以减少鱼体内无机汞含量的51.1%,同时促进了无机汞在粪便中的排除。工程菌株有效的保护鲫鱼不受环境中无机汞的污染,通过吸附作用缓解无机汞在鱼体内的毒性,而且工程菌株缓解了鱼肠道微生物在汞暴露条件下的变化,对鱼肠道微生物起到保护作用,这一新的技术有望控制无机汞对鱼类的污染。2.无机汞很容易被某些微生物转化为甲基汞,而且甲基汞进入食物链以后会不断的积累。本文从健康鲫鱼粪便中分离到一株大肠杆菌W-1,并将一个含有七个氨基酸的甲基汞结合多肽展示在大肠杆菌W-1细胞表面,此工程菌株对甲基汞具有很高的亲和力和结合能力,在12μM甲基汞溶液中的吸附效率达96%以上,吸附效率是野生型大肠杆菌的4倍,而且不受其他金属离子的干扰,温度对工程菌株的吸附作用影响不大。而且通过透射电镜确认甲基汞吸附在工程菌株的细胞膜上。本实验以鲫鱼作为动物模型,将工程菌株喂给鲫鱼,发现食用了工程菌株的鱼体内甲基汞含量比没有食用工程菌的鱼降低了36.3%,而鱼粪便中的甲基汞增加了36.7%。工程菌株吸附了甲基汞阻止其被鱼体内吸收,吸附了甲基汞的菌株最终随粪便排出,通过这种方法可以减少甲基汞在鱼体内的富集。3.大量的抗生素应用于养殖行业导致牲畜粪便中含有高浓度的抗生素残留,这些残留的抗生素会抑制后续的厌氧发酵。在该研究中,利用细胞表面展示技术将β-内酰胺酶展示在大肠杆菌的细胞表面获得全细胞生物催化剂的工程菌株,这个工程菌株具有较高的酶活(4.93 U/mg细菌干重),能高效降解β-内酰胺类抗生素,与游离的β-内酰胺酶相比,全细胞催化剂具有更高的稳定性。在室温条件下存放60天后的酶活性为最初酶活的82.7%,但是游离的β-内酰胺酶的酶活性降为18.0%。100 mg/L的青霉素、头孢唑林和阿莫西林分别在一小时内可以完全降解。用全细胞催化剂前处理含有β-内酰胺类抗生素的猪粪提高厌氧发酵产甲烷(93.2%),他可以通过降解抗生素避免发酵体系中微生物群落结构的变化,从而有利于产甲烷菌的生长。这种新型的策略不仅消除了粪便中残留的抗生素,而且还提高了甲烷产量,因此实现了可再生能源的最大化利用。4.红霉素是大环内酯类抗生素之一,广泛应用于药疗和畜禽等行业,红霉素是环境中检出率较高的抗生素之一。利用细胞表面展示技术将红霉素酯酶展示在大肠杆菌的细胞表面获得全细胞生物催化剂的工程菌株,该工程菌株的红霉素酯酶酶活力为1.0 U/mg细菌干重,酶活反应的最佳温度为30℃,最佳pH为7。全细胞生物催化剂能在24 h内完全降解50 mg/L的红霉素,酶的稳定性很高,室温下存放40天后依然能保持初始酶活的86%。此工程菌株可以回收利用,重复使用7次后的酶活性达最初活力的80%。为了减少环境中的红霉素残留,该全细胞生物催化剂用于含红霉素的生活废水处理,降解效率达100%。
【图文】：

示意图,无机汞,鱼类,技术

学博士学位论文利用细胞表面展示技术去除典型环境污染物的研究机汞残留的报道甚少。由于汞具有快速富集和缓慢排除的特点，，本章个能够结合无机汞的多肽展示在细胞表面上获得全细胞吸附剂，让这附剂定植在鱼肠道内以期减少鱼体内的无机汞含量。因此，本章节将结合多肽通过基因工程的手段展示在大肠杆菌的细胞表面以期吸附以鲫鱼（Carassius auratus）为动物模型，测试工程菌株是否可以减汞含量（如下图 2-1 所示）。

示意图,鲫鱼,示意图,鱼粪

注：标准鱼食+ E. coli GC：在每克标准鱼食中含有 2 ×108CFU E. coli GC；标准鱼食+ E. coli PC：在每克标准鱼食中含有 2 ×108CFU E. coli PC；标准鱼食+ Hg2+：在标准鱼食中含有 Hg2+0.1 mg/kg。鱼的实验分为两个阶段，如下图 2-2 所示，第一阶段：最开始的 10 天用含有工程菌株的鱼食饲养，这样可以使工程菌株定植在鱼的肠道内。第二阶段：10天之后改变鱼饲养的食物，换为含有 Hg2+的食物，持续饲养 30 天，整个鱼实验周期为 40 天，每天投喂鱼食两次，所给的食物在 5 min 中内食用完，未食用的残留食物立即捞出来以免影响水质，每天换 1/4 的水。鱼粪的收集，喂食 2 h 后收集粪便，从鱼缸底部吸出鱼的粪便，通过离心（6000 rpm, 10 min）去除多余的水份。由于每次收集的粪便量较少，所以，同一组鱼收集 5 次的粪便混合在一起测定总汞含量，取适量鱼粪便加入 68%的浓硝酸过夜处理，再加 2 mL 30%过氧化氢，在消解炉里进行消解，定容，过滤后利用 AFS 测定总 Hg 含量。Hg only 标准鱼食标准鱼食 + Hg2+GC-Hg 标准鱼食 + E. coli GC 标准鱼食 + Hg2+PC-Hg 标准鱼食 + E. coli PC 标准鱼食 + Hg2+
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：X70

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