原生质体融合高效反硝化菌及其脱氮研究

发布时间：2020-05-30 18:36

【摘要】：氮素仍然是当前地表水体水质污染的重要源头之一,新的脱氮处理工艺、新的填料和新的脱氮细菌等的探索和研究是生物脱氮技术的发展趋势。随着各种新工艺的不断推出,工艺构筑物内脱氮菌群的效能成为制约新工艺推广和使用的关键因素之一。生物技术的引入带来了新的变化。本文拟利用原生质体融合技术,采用脱氮效能较高的原生态菌株作为原生质体融合的亲本菌株,以此建立微生物的转化体系,来获取更高效的脱氮菌,以期为城市污水处理的脱氮提供新的研究方向,为提高脱氮菌的脱氮效率开辟新的方法。本文首先进行了原生态氨氧化菌、硝化菌和反硝化菌的筛选,分别绘制生长曲线并测定其性能。接着进行了原生态组合脱氮菌的脱氮性能研究,之后进行了优选反硝化菌的原生质体融合及优选融合子的脱氮性能研究,并通过性能对比和16S rDNA基因测序手段甄别了优选融合子的亲本菌,对比了原生态组合脱氮菌与优选融合子组合脱氮菌的脱氮效能。本文的主要结论有: (1)通过专用培养基,采用极限稀释法和平板划线法,筛选获得三株较高效的反硝化菌FX1,FX2和FX3,经鉴定,菌株FX1和FX3为芽孢杆菌属,FX2为沙雷氏菌属。绘制反硝化菌FX1,FX2和FX3的生长曲线,进行脱氮性能对比实验。结果表明,菌株FX1,FX2和FX3均有脱氮功能,菌株的四个生长周期较为明显,0-4h为其延缓期,4-16h为对数期,TIN去除率明显增大,16-20h后为稳定期,TIN去除率仍有所增长,但增速减缓,20h后为衰亡期,对TIN的去除效果明显减弱,直至稳定。三株菌株中,FX2为反硝化效果最优,FX1次之,FX3菌株最差;单因素实验结果显示,在温度低于30℃时,其脱氮率随温度升高而增大,但当温度高于30℃后,其脱氮率呈随温度升高下降的趋势;正交实验表明:影响反硝化菌株FX1的脱氮效率的因素的主次顺序依次为:培养时间温度pH值;影响菌株FX2的脱氮效率的因素的主次顺序依次为:温度培养时间pH值。反硝化菌株FX1各因素中最佳的反硝化条件为:培养时间为14 h,温度35℃,pH为7.5;反硝化菌株FX2的最佳反硝化条件为:培养时间为16 h,温度25℃,pH为7.0。 (2)根据显色反应,确定氨氧化富集培养基I作为实验用氨氧化菌富集培养基,分离、纯化得到1株氨氧化菌A1。绘制其生长曲线,表明其生长周期较长,前3天生长非常缓慢,NH3-N的去除率也相应较低,第4-7天是氨氧化速率明显提高;在确定硝化菌富集培养基Ⅰ为较优硝化菌培养基后,分离、纯化得到3株硝化菌X1、X2和X3。选定硝化菌X2进行最优硝化条件的L9(34)正交实验。结果表明,影响硝化菌X2平均日硝化速率的因素的主次顺序依次为:培养时间温度pH;硝化菌X2的最佳硝化条件为:温度30℃,pH值为7.0,培养时间为6d。 (3)配制模拟污水,进行原生态组合脱氮菌的脱氮实验。测得配置后的模拟生活污水主要水质指标为:COD=300-350mg/L,TP=6.9-9.2mg/L,NH3-N=16.2-20.5 mg/L。以总氮去除率计时,只有氨氧化菌或硝化菌时,总氮去除率很低,当氨氧化菌和硝化菌组合时,总氮去除率略有提高,表现出复配效应,但效能仍然较低。当氨氧化菌、硝化菌和反硝化菌组合时,总氮去除率有较为明显的提高,均高于90%,且组合Ⅰ的总氮去除率较优于组合Ⅱ。菌种组合过程中,表现出明显的群体效应。 (4)优选脱氮菌的原生质体融合实验及融合子组合脱氮菌的脱氮实验。将优选得到的氨氧化菌A1、硝化菌X2以及反硝化菌FX1、FX2进行了紫外诱变和抗药性筛选。在紫外诱变过程中,FX1和FX2对紫外线的耐受能力较强,A1菌株次之,而X2菌株对紫外线照射最为敏感。为了保证致死效果,FX1菌株和FX2菌株照射80s,得到突变菌株FXB1和FXB2。抗药性筛选过程中,采用青霉素G钠盐和链霉素作为抗药性标记,在选择压为40μg/mL时进行了抗药性正突变菌株的筛选,将有单重抗药性的突变菌株进行了5次传代培养,选择具有稳定遗传性的正突变菌株作为原生质体融合的亲本菌株。原生质体制备过程中,所采用的溶菌酶浓度为400μg/mL,酶解温度为30℃,酶解时间为10-16h。原生质体融合过程中,采用平均分子量为6000,质量浓度为40%的PEG促融。实验中采用的促融时间为6min,促融架桥的Ca2+浓度为0.015mol/L。在经过6代传代培养后,经双抗平板筛选,得到R1、R2、R3、R4、R5等5种融合子。 (5)将挑选出的融合子R1、R2、R3、R4、R5和亲本菌株A1、X2和FX1、FX2(作为对照)按10%的接种量接入250mL的模拟污水(将富集培养基稀释5倍)中进行脱氮实验,筛选出融合子R2为反硝化效果得到明显提高的反硝化菌融合子。通过16S rDNA基因的PCR扩增及序列分析,进行DNA含量对比,判断融合子R2的亲本菌株是反硝化菌FX2。 (6)绘制融合子R2的生长曲线。结果表明,通过融合之后,融合子的生长量有一定增加。利用模拟污水测定了其脱氮性能,在0-4h阶段优选融合子R2与亲本菌FX2的反硝化效能比较接近,但在4-8h时,两种菌的反硝化效能开始明显变化,融合子R2的总氮去除率优于亲本菌FX2,这种优势一直持续到22h,最大差别为27.58%(16h时)。说明通过原生质体融合技术,可使优选反硝化菌的脱氮效能得到27%左右的提高。 (7)进行了原生态组合脱氮菌和优选融合子组合脱氮菌的脱氮实验。将原生态组合脱氮菌中的优势组合A1+X2+FX1与优选融合子组合脱氮菌A1+X2+R2进行脱氮效能对比实验,结果显示,优选融合子组合脱氮菌的脱氮效能一直略优于原生态组合脱氮菌,特别是在0-8h期间较为明显,在后续时段,虽有优势,但差别较小,说明优选融合子的加入提高了组合脱氮菌的效能,但随着时间的增长,其优势逐渐变小。
【图文】：

尺寸图,细胞图,价态变化,硝化-反硝化

项目亚硝酸菌硝酸菌细胞形状椭球或棒状椭球或棒状细胞尺寸/μm 1×1.5 0.5×1.0革兰氏染色阴性阴性世代期/h 8-36 12-59自养性专性兼性需氧性严格好氧严格好氧氧化 1g NH4+-N 增值量/g 0.146 0.019最大比增长速率/(μm/h) 0.04-0.08 0.02-0.06产率系数 Y/(基质细胞mgmg) 0.04-0.13 0.02-0.07饱和常数 K/(mg/L) 0.6-3.6 0.3-1.7在硝化反应中，NH4+-N 向 NO3--N 的转化过程中总氮量未发生变化。氮元素的价态变化见图 1-1 所示。

原理图,反硝化作用,细菌,反硝化菌

和光均可作为反硝化菌的能量来源[20-24]。Pseudononas（假单胞菌）和Alcaligene产碱杆菌属）是自然界最普遍的反硝化菌，相对于这两个属而言，其它反硝化菌只在某些特殊的环境中才居优势，，出现频率较低[25]。.2.3 反硝化作用细菌的反硝化过程可以表示为：NO3－NO2-NO N2O N2关[26,27]。细菌反硝化作用原理如图 1-3 所示：N2硝酸还原酶亚硝酸还原酶NO 还原酶O 还原酶
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：X703

【参考文献】