洛克沙胂残留的生态毒理研究

发布时间：2020-06-13 15:38

【摘要】： 洛克沙胂(roxarsone, ROX)是一种目前在畜禽养殖中广泛使用的有机胂饲料添加剂,具有广谱杀菌和抗球虫作用,可提高饲料利用率,有明显的促生长作用。我国允许使用的有机胂饲料添加剂有洛克沙胂和氨苯胂酸,以前者应用较多。洛克沙胂进入动物体后,主要以药物原形随粪便排泄,在鸡粪便中的残留浓度达10～50mg/kg(以As计)。在我国,畜禽粪便一般只经简单处理或不处理,作为有机肥用于农业肥料。随有机肥使用或随养殖场排污系统,洛克沙胂进入环境后,对土壤和水质量有影响,可增加环境中的砷含量,可能对环境中的微生物、动植物等产生生态毒性。热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是在机体受到应激后产生的蛋白质,具有高度的保守性,对维持细胞生存和内环境稳定起重要作用。按分子量可分为HSP90、HSP70、HSP60和小分子量HSP,其中HSP70是HSP家族中最为保守和最重要的一族,在细胞受到应激后比其他HSP响应明显。HSP70的应激响应性质被作为生物标志物用于各种应激的研究中,在环境污染监测中的应用也逐渐增多。本文模拟畜禽粪便中洛克沙胂残留水平,从以下几方面:⑴洛克沙胂残留对土壤呼吸作用、硝化作用、氨化作用及对土壤几种酶活性的影响;⑵洛克沙胂污染土壤中对小白菜、番茄生长的影响及在植物体中砷含量的变化;⑶洛克沙胂在土壤中的消除特性研究;⑷洛克沙胂在不同深度土壤中的吸附迁移特性;⑸洛克沙胂诱导斑马鱼不同组织中HSP70表达,研究洛克沙胂残留对土壤的生态毒性及HSP70作为生物标志物对畜禽粪便中洛克沙胂污染环境的监测。将洛克沙胂残留设为20、50、80、150、250mg/kg剂量组,按土壤微生物及酶测定的常规方法,分析洛克沙胂在不同培养时间对土壤呼吸作用、硝化作用、氨化作用、脲酶、碱性磷酸酶、蛋白酶、过氧化氢酶的影响。试验结果显示,对土壤呼吸强度没有显著性影响;对土壤的硝化作用有抑制作用,且随着残留水平的提高,抑制作用加强;对土壤氨化作用有较明显抑制;对碱性磷酸酶的活性有较明显的刺激作用;低剂量的洛克沙胂对土壤过氧化氢酶活性有一定的促进作用;对蛋白酶活性表现出先抑制,后有一定的促进作用;对土壤脲酶的活性在一定时间内有轻微的加强作用。通过盆栽试验,在不同时间测量植株的株重、株长、叶长、根长,研究洛克沙胂不同残留水平对青菜和番茄生长的影响;通过原子荧光光度法测定总砷,了解植株内砷含量的动态变化。试验结果表明,较高残留水平时青菜株重明显减轻,叶长和株长较正常对照组显著变短(P0.05),对青菜的根长没有明显影响(P0.05)。低剂量时(≤80mg/kg),洛克沙胂对番茄株重、株长有明显的促进作用(P0.05),大于80mg/kg剂量时则有抑制现象,但差异不显著(P0.05);150、250mg/kg两个剂量组对40d后的番茄根长有明显抑制作用,而对叶长无明显影响。50d时青菜和番茄中砷的含量达到峰值,随后番茄植株中的总砷会以较快的速度消除,至100d时砷含量均低于3mg/kg;而青菜中的砷消除较慢,至90d时,150和250mg/kg组青菜中的砷含量还高于12mg/kg。建立了高效液相色谱法(HPLC)测定土壤中洛克沙胂含量的方法,ROX的工作曲线为y = 17.726x , R2 =0.9991;线性范围在0.10μg/L～20.00μg/L;在洛克沙胂0.2、2.0、10.0mg/kg添加水平,方法的回收率分别为81.60%、84.12%、92.82%,批内批间RSD均小于7%;LOD为0.04mg/kg ,LOQ为0.2mg/kg。青菜和番茄盆栽试验中不同时期的土壤样品,通过高效液相色谱法测定其中洛克沙胂的含量,数据表明,ROX在土壤中的消除是缓慢的,至60d时,除20mg/kg洛克沙胂组在土中的浓度为1.59mg/kg外,其他各处理组在土中的含量均大于6mg/kg (6.42～22.86mg/kg)。若将ROX在土中的消除以线性消除来模拟,则在种植番茄、青菜的土中的ROX平均消除半衰期约为26.6d～44.9d。采用平衡振荡法研究了洛克沙胂在不同深度土壤中的吸附,结果表明,洛克沙胂进入土壤后,不同深度土壤中的吸附Bt2Bt1Ap,表层土Ap与下层土Bt1、Bt2对ROX的吸附有显著差异(P0.05),但Bt1、Bt2间差异不显著(P0.05);表层土中有机质去除使对ROX的吸附明显增加(P0.05),而去除有机质的下层土Bt1和Bt2对ROX的吸附无明显影响;土壤对ROX的吸附较好地符合Fettre线性模型,吸附常数在0.1941～0.5979。根据土壤有机吸附常数和吸附自由能的大小对洛克沙胂的移动性能进行了评价,认为其在3种土壤中均以物理吸附为主,且具有较高的移动性。通过对吸附常数Kd与土壤有机质含量、CEC和土壤溶液pH值的关系进行分析,发现土壤有机质含量、CEC量和土壤溶液pH值在吸附过程中均属支配因素,Kd与土壤有机质含量、CEC量、土壤溶液pH值呈负相关。不同淋洗液水、0.01mol/L CaCl_2和0.01mol/L EDTA-Na_2对洛克沙胂在不同深度土壤中的淋洗作用不同。水对表层土和Bt2土中ROX有较好的淋洗作用,而在Bt1土中,0.01mol/LEDTA-Na_2有较好的淋洗作用;鸡粪浸提液的主要成分为有机质,加入鸡粪浸提液是为了模拟畜禽粪便中有机质与ROX进入土壤后的淋溶迁移。从淋洗率来看,ROX在不同深度土壤中被水、0.01mol/L CaCl_2和0.01mol/L EDTA-Na_2淋洗率在72.3%～100.4%,说明ROX在土壤中的迁移是水溶性的,可在不同深度的土壤中迁移,在土壤中未发现有明显吸附和赋积行为。但洛克沙胂这种水溶性的迁移,可能会较快地进入地表水和地下水中,造成对水环境质量的影响。在100mg/L洛克沙胂诱导斑马鱼HSP70、HSC70及HSF1表达试验中,通过免疫组织化学、RT-PCR和荧光定量PCR分析,结果表明洛克沙胂可诱导斑马鱼鳃、性腺和肝脏组织表达HSP70、HSC70及HSF1。免疫组化显示HSP70在鳃的基底组织、鳃弓、平滑肌、鳃小片的上皮细胞及红细胞的胞质中有表达;在睾丸和卵巢的基质细胞的胞质中有强阳性黄色颗粒;在肝脏组织中,多见中央静脉周围及红细胞胞质中有较淡的黄色表达。荧光定量PCR结果说明斑马鱼性腺、鳃和肝脏中hsp70、hsc70和hsf1三种基因在洛克沙胂诱导后12h,均有最高表达。相对于空白组织的表达量,12h时性腺中这三种基因的表达倍数,性腺中达26.43、13.70、17.53倍;鳃中分别为52.89、34.83、59.31倍;肝脏中分别为4.59、3.82、3.32倍。从表达峰值来看,这三种基因在鳃中表达最高,性腺中次之,肝脏中最少。在诱导6h时,鳃组织中这三种基因的表达即分别达4.97、2.50、18.61倍;肝脏中表达量分别为1.75、2.24、1.77倍;而性腺中分别为1.05、0.62、1.89倍。从时间上来看,这三种基因的诱导表达启动鳃最早,肝脏次之,性腺相对较晚。综上所述,HSP70及相关蛋白显示出作为生物标志物在有机胂环境污染中应用的可能性,还有待进一步深入研究。
【图文】：

斑马鱼,正常组织,免疫组化,性腺

68图 3-1 斑马鱼正常组织免疫组化图a, b, d: 分别为肝、鳃、性腺(纵切) 100×；c, e: 鳃、性腺 400×Fig.3-1 Immunohistochemical picture of normal zebrafish tissuesa, b, d: liver, gill and gonad 100×; c, e: gill and gonad 400×

洛克沙胂,免疫组化

图 3-2 洛克沙胂诱导鳃 HSP70 阳性免疫组化图a, b, c：鳃 100×；d, e, f, g, h：鳃 400×Fig.3-2 Positive express of HSP70 in gill of zebrafish exposed to 100mg/L roxarsonea, b, c：gill 100×；d, e, f, g, h：gill 400×
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：X592

【引证文献】