防治脱氧雪腐镰刀烯醇毒素污染的脂肽类抗菌物质的研究

发布时间：2020-06-18 16:24

【摘要】：禾谷镰刀菌是自然环境中小麦赤霉病的主要致病菌，在生长和侵染作物过程中产生脱氧雪腐镰刀烯醇毒素（DON），联合国粮农组织和世界卫生组织将DON定为“最危险的自然发生食品污染物”。我国多次对小麦、玉米及相关制品的真菌毒素污染调查结果显示，样品DON毒素污染率较高。目前主要使用化学杀真菌剂如多菌灵等防治禾谷镰刀菌的污染。大部分农药残存在自然环境中，严重威胁生态环境安全、农产品质量安全、人和动物的生命安全。生物学防治是目前比较有应用前景的控制病原真菌及其毒素污染的措施，同时能够减少化学农药使用量、降低农业面源污染。生物农药高效、安全、环境相容性好，具有巨大的开发潜力。但是，关于微生物防治储藏小麦DON毒素污染的报道较少。因此本课题对实验室保存的分离自花生果壳、种子及荚果际等处的细菌进行筛选，以期获得在储藏环境条件下能够抑制麦粒中禾谷镰刀菌生长和毒素产生的细菌及其活性物质，为开发用于储粮的新型生物农药奠定基础。本研究首先利用平板对峙实验，初筛到44株对禾谷镰刀菌菌丝体生长抑制率在40%以上的菌株。Tip culture实验对细菌发酵上清液的镰刀菌抑制活性进行了检测，结果38株菌显示90%以上的抑制率。禾谷镰刀菌侵染麦粒实验检测了细菌发酵上清液对DON毒素产生的影响，在镰刀菌侵染麦粒18天后，HPLC检测毒素的相对含量，结果14株菌的抑毒率在50%以上，其中菌株WPS4-1和WPP9的活性最高，抑制率90%左右。对14株细菌进行了形态、生理生化鉴定及16S RNA基因和gyrA基因分子鉴定，表明所有菌株均为芽孢杆菌属，与解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens的亲缘关系最近。用不同的温度（35°C、60°C和121°C）、不同pH（pH1.0、3.0、5.0、9.0、11.0和13.0）和3种蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K）对拮抗细菌的发酵上清液进行处理，结果表明拮抗物质对温度和酸性条件具有较好的稳定性，对胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感。为了初步判断拮抗物质的类别，选择了芽孢杆菌属真菌拮抗物质的基因相对应的19对引物，对拮抗菌的基因组DNA进行扩增。结果14对引物获得了阳性扩增，基因序列经数据库比对，与目的基因相似性在97~99%。因此判断基因组中含有与通过核糖体途径合成的羊毛硫类抗菌物质ericin和sublancin、以及通过非核糖体途径合成的脂肽类抗菌物质伊枯草菌素家族iturins、表面活性素surfactin、芬荠素fengycin和杆菌溶素bacilysin等合成相关的基因。分别使用硫酸铵沉淀、有机溶剂沉淀、有机溶剂萃取和盐酸沉淀等方法分离细菌发酵上清液中的禾谷镰刀菌拮抗物质。60%饱和度硫酸铵沉淀物对禾谷镰刀菌的抑制率为78.07±3.21%，乙醇沉淀物和丙酮沉淀物的抑制率仅为4.92±1.81%和9.61±1.04%，四种有机溶剂乙酸乙酯、正丁醇、苯和氯仿萃取物的抑制率分别为87.01±2.41%、78.11±5.97%、73.16±3.29%和46.17±4.42%，盐酸沉淀的甲醇提取物的抑制率为100%。因此根据粗提物的禾谷镰刀菌抑制活性，判断盐酸沉淀的方法分离效果最好。吸附实验表明，大孔树脂D296R和D301R具有较高的色素吸附而较低的活性物质吸附能力，适合细菌发酵上清液中色素杂质的去除。去色素的上清液经浓盐酸沉淀（pH3.0）、甲醇抽提，获得脂肽粗提物。去色素上清液与脂肽粗提物的MALDI-TOF-MS质谱检测结果表明，WPS4-1可以产生伊枯草菌素和表面活性素类抗菌物质。对脂肽粗提物的抗禾谷镰刀菌活性及机理进行了探讨。Tip culture实验获得脂肽粗提物对禾谷镰刀菌菌丝体生长的半数抑制浓度IC50为8.51μg/mL，禾谷镰刀菌侵染麦粒实验表明，脂肽粗提物可以延迟或抑制其孢子的萌发，减少毒素的产量。光学显微镜和扫描电镜观察表明抑制作用体现在抑制孢子萌发和使菌丝畸形破裂，而且随脂肽浓度增加，抑制作用增强。脂肽粗提物处理的镰刀菌培养液的电导率增加，提示菌丝细胞膜受到破坏。荧光定量PCR分析表明含120μg/mL脂肽粗提物的培养液中生长的菌丝体，其Tri5基因的表达量明显低于对照，说明脂肽粗提物通过抑制DON合成基因的表达实现对镰刀菌产毒的抑制作用。芽孢杆菌脂肽类抗菌物质的生物合成受发酵培养基组分和发酵条件的影响。采用单因素实验和均匀设计实验确定拮抗菌株发酵产脂肽类抗菌物质的最佳培养基组成为小米面13.7g/L、黄豆饼粉2.5g/L和硝酸钠3.0g/L。用此培养基发酵获得的上清液对禾谷镰刀菌的抑制率为90.38±1.33%，明显高于原培养基的抑制率79.25±0.87%。单因素实验确定最佳发酵温度为32°C，10L发酵罐脂肽产量最大的发酵时间为4天。本研究获得了多株对禾谷镰刀菌及其DON毒素有较强抑制活性的细菌，提供了鉴定及分离脂肽类抗菌物质的方法，初步探索了脂肽发挥抗真菌作用的机理，为脂肽类抗菌物质防治储粮真菌及其毒素污染的应用提供了理论依据。
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：X56;X172
【图文】：

β-不饱和酮,不饱和酮,化学名称,基组

不饱和酮基组成（图 1-1），化学名称为 39 烯 8 酮（3, 7, 15 trihydroxy 12, 其中的的 12，13 环氧环是其表现毒也随之降低。α，β-不饱和酮基致使其。

毒素,烯族毒素,镰刀菌属,生物合成途径

镰刀菌属单端孢霉烯族毒素生物合成途径[22]

【参考文献】