二甲戊灵降解菌株分离鉴定、降解途径分析及硝基还原酶基因克隆

发布时间：2020-06-22 12:30

【摘要】：二甲戊灵[N-(1-乙基丙基)-2,6-二硝基-3,4-二甲苯胺],属于二硝基苯胺类除草剂,是世界上销售量第三大的除草剂及销售量最大的选择性除草剂,广泛应用于防除旱田和菜田中的一年生禾本科杂草和某些一年生阔叶杂草。但二甲戊灵化学性质稳定,在环境中残留期较长,对水生生物及陆生无脊椎动物高毒,且具有潜在致癌性。因此研究二甲戊灵在环境中的迁移转化等行为,阐明二甲戊灵在环境中的降解过程和机制,对于评估二甲戊灵应用后的环境行为、毒理和生态安全性具有重要意义。研究表明微生物降解代谢是环境中二甲戊灵消解的主要因素,近年来,已分离筛选到多株降解二甲戊灵的细菌和真菌,并鉴定了多个中间降解产物。但二甲戊灵微生物降解的代谢途径全过程及参与其中的酶和基因至今还没有得到阐明。同时,分离筛选高效的二甲戊灵降解菌株可用于研发二甲戊灵残留污染生物修复技术,具有很强的应用价值。此外,除草剂降解/脱毒酶基因在抗除草剂转基因工程领域具有潜在的应用价值,而我国目前还缺乏具有自主知识产权的性能优良的除草剂降解/脱毒酶基因。抗除草剂转基因工程可以极有效地控制农田杂草,其中最为成功的是抗草甘膦转基因作物,已经大量种植。但长期使用草甘膦带来严重的杂草抗性问题,急需发掘其它除草剂降解/脱毒酶基因,为研发新的抗除草剂转基因作物提供基因资源。二甲戊灵是一种广泛使用的杀草谱较广的除草剂,可作为抗除草剂转基因工程的靶标除草剂,因此二甲戊灵降解/脱毒酶基因在构建抗除草剂作物中具有很好的应用前景。本论文利用微生物富集驯化技术从活性污泥中分离到一株高效的二甲戊灵降解菌株Y3,对该菌株进行了分类鉴定,利用高效液相色谱(HPLC)和串联质谱(MS/MS)技术对菌株Y3降解代谢二甲戊灵的产物进行鉴定,发现了 2个新的代谢产物。克隆到二甲戊灵降解关键基因硝基还原酶基因pnr,研究了 PNR的酶学特性。本文从菌株、酶学和基因水平对二甲戊灵的微生物降解机制进行了阐述。研究结果为进一步深入研究二甲戊灵在环境中的降解规律和机制提供理论依据,为研发二甲戊灵残留污染土壤和水体生物修复技术提供高效降解菌株,为抗除草剂转基因作物的构建提供具有我国自主知识产权的性能优良的降解基因。本研究主要研究结果如下:1二甲戊灵降解菌株的分离筛选与鉴定以二甲戊灵为底物,通过富集驯化技术从处理二甲戊灵生产废水的活性污泥中分离纯化得到一株二甲戊灵高效降解菌株,命名为Y3。菌株Y3能以二甲戊灵为唯一碳源和能源生长,在36 h内能降解82%的100 mg/L二甲戊灵,60 h内能降解100%的100 mg/L二甲戊灵。菌株Y3在LB平板上菌落形态呈乳白色,边缘褶皱不规则,菌落表面较干燥,革兰氏染色呈阳性,菌体杆状、好氧、产芽孢和周生鞭毛运动。16SrRNA基因系统发育进化分析表明菌株Y3与Bacillus属的亲缘关系最近,与Bacillus subtilis菌株聚成一个分支。菌株Y3的16S rRNA基因序列与Bacillussubtilis subsp.inaquosorum KCTC 13429T 的 16S rRNA 序列相似性达到 99.9%,与Bacillus subtilis subsp.subtilis NCIB 3610T 的相似性为 99.4%,与Bacillus subtilis subsp.spizizenii NRRL B-23049T的相似性为99.1%。DNA-DNA杂交结果表明菌株Y3和Bacillus subtilis KCTC 13429T杂交率为75.3%,高于70%这一种间的界定阈值。结合菌株Y3的菌落形态特征、生理生化特征、16SrRNA基因系统发育进化分析和DNA-DNA杂交,将菌株Y3鉴定为 Bacillus subtilis。菌株Y3降解二甲戊灵的最适温度为30℃,最适pH为7.5。菌株Y3能降解二硝基苯胺类除草剂其他三种主要品种仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵,菌株Y3对二甲戊灵、仲丁灵和氨磺灵的降解速率没有显著差异,但对氟乐灵的降解速率显著低于二甲戊灵。此外菌株Y3还能降解二苯醚除草剂乳氟禾草灵和乙羧氟草醚。2菌株Y3降解二甲戊灵的代谢产物鉴定和代谢途径研究采用HPLC-MS/MS方法对菌株Y3降解二甲戊灵的代谢产物进行了鉴定。HPLC检测到3个保留时间分别为8.92 min、4.85 min和4.5 min的产物峰,其[M+H]+分别为m/z252.17、m/z266.15和m/z250.12,经MS/MS分析将这三个产物分别鉴定为6-氨基二甲戊灵、5-氨基-2-甲基-3-亚硝基-4-(戊烷基-3-氨基)-苯甲酸和8-氨基-2-乙基-5-(羟甲基)-1,2-二氢喹喔啉-6-羧酸。根据代谢产物鉴定结果推测菌株Y3降解二甲戊灵的部分代谢途径为:首先通过硝基还原作用将二甲戊灵转化成6-氨基二甲戊灵,进而又发生硝基还原作用和羧化作用生成5-氨基-2-甲基-3-亚硝基-4-(戊烷基-3氨基)-苯甲酸,随后发生环化和羟基化作用得到8-氨基-2-乙基-5-(羟甲基)-1,2-二氢喹喔啉-6-羧酸。3菌株Y3中二甲戊灵硝基还原酶基因pnr的克隆与鉴定为克隆菌株Y3的二甲戊灵硝基还原酶基因pnr,首先通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose fast flow阴离子交换层析、疏水层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析等蛋白纯化技术对菌株Y3的二甲戊灵硝基还原酶进行了纯化。经四步纯化后,二甲戊灵硝基还原酶的比酶活由起始的0.38 U/mg protein提高到了 18.5 U/mg protein,目标蛋白浓缩了 48.7倍。纯化得到的二甲戊灵硝基还原酶经Native-PAGE电泳后割胶,利用MALDI-TOF-MS技术进行蛋白质肽指纹图谱分析,将获得的肽段序列与菌株Y3基因组框架图中注释的蛋白氨基酸序列进行匹配分析,结果找到一个注释为硝基还原酶的 ORF(ORF03879)。将该 ORF 连入 pET29a(+)后导入Escherichia coli BL21(DE3)进行蛋白异源表达,产物通过亲和层析纯化。酶活测定结果表明纯化的表达产物具有二甲戊灵硝基还原酶活性,比酶活为25.1 U/mg protein。UHPLC-MS/MS和1H NMR鉴定结果表明PNR催化了二甲戊灵芳环C-6硝基基团的还原,生成产物6-氨基二甲戊灵,说明该ORF就是pnr。PNR由209个氨基酸组成,编码基因630 bp,蛋白分子量约为23 kDa。对蛋白氨基酸序列进行比对分析,PNR与B.subtilis subsp.strain 168中的一个功能未鉴定报道的NAD(P)H依赖型硝基还原酶YdgI有100%的序列相似性。在催化功能已鉴定并公开报道的硝基还原酶中,PNR与来源于Lactobacillus plantarum WCFS1的硝基苯甲酸硝基还原酶PnbA氨基酸序列相似性最高(仅35%),PNR与来源于Synechocystis sp.的醌还原酶DrgA有31%的氨基酸序列相似性,与Vbrio fischeri的NAD(P)H-flavin氧化还原酶Frase Ⅰ氨基酸序列相似性达到29%,与Pseudomonas putida的NAD(P)H-依赖型的氧化还原酶PnrB的相似性为28%。蛋白氨基酸系列系统发育进化分析表明二甲戊灵硝基还原酶PNR是Ⅰ型硝基还原酶GroupB亚家族B1中的一员。实时荧光定量PCR检测结果表明pnr基因在菌株Y3中为组成型表达。4二甲戊灵硝基还原酶PNR的酶学特性研究PNR的最适反应pH为7.0,最适反应温度为35℃;PNR在pH5.0或pH8.8,及温度高于50℃时不稳定。1.0mM的Li+、K+、Co~(2+)、Mn~(2+)和Ni~(2+)对酶活没有显著影响,1.0 mM的Mg~(2+)、Ca~(2+)、Fe~(2+)和Fe3+对酶活有一定的促进作用,而1.0 mM的Cd~(2+)、Hg~(2+)、Cu~(2+)、Ag+和Zn~(2+)对酶活有一定的抑制作用。100.0mMEDTA对酶活没有明显影响,100.0 mM SDS对酶活有微弱的抑制作用。100.0 mM还原剂DTT能显著促进PNR的活性。PNR仅能催化二甲戊灵的芳环C-6位的硝基还原为氨基,不能催化芳环C-2位硝基的还原。此外,PNR还能连续催化仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的两个芳环硝基基团还原。PNR对二甲戊灵、仲丁灵、氨磺灵和氟乐灵的Vmax/Km分别为33.63、33.34、33.31 和 31.10。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X172;X592
【图文】：

固氮菌,中间产物,二硝基苯胺,脱烷基

叫叩樷／／７？的降解效率最高，在２０邋ｄ内能完全降解１０邋ｍｇ／Ｌ二甲戊灵。Ｚ７！邋0＾７？0／７／／７？逡逑主要通过两条途径代谢转化二甲戊灵：一是部分硝基还原生成６－氨基二甲戊灵（ＰＲ），逡逑二是通过Ｎ端脱烷基生成产物３，４－二甲基－２，６－二硝基苯胺（ＤＡ）（图１－４）。／＞／ｃｉ／７如逡逑0ｎｒ＾Ｃａｖ也能有效降解二甲戊灵，降解率为７９％，生成的中间代谢产物是二甲戊灵逡逑９逡逑

富集,土样,富集培养,梯度稀释

灵的富集培养液。紫外－可见光扫描检测发现含有土样的处理组中的二甲戊灵含量明逡逑显低于不添加土样的ＣＫ组，２００？６００邋ｍｎ波长范围内二甲戊灵的特征吸收峰明显下降，逡逑说明二甲戊灵被大量降解了（图２－１），土样富集液中二甲戊灵被降解了邋４３邋ｍｇ／Ｌ。逡逑：．ｏｏｃ－逦？逡逑（１逡逑，鲁一ＣＫ逡逑＾邋Ｉ邋．ＯＯＣ－逦１逦？逡逑０．５００－邋Ｖ逦＼逦－逡逑０．０００逦１邋＾逡逑２００．００逦３００邋００逦４００．ＪＫ）逦５００．００邋５５Ｕ逡逑ｎｍ逡逑图２－１二甲戊灵降解富集液紫外－可见光扫描图谱逡逑ＣＫ，二甲戊灵空白对照；处理，添加土样的二甲戊灵富集液。逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋ＵＶ－ｖｉｓｉｂｌｅ邋ｌｉｇｈｔ邋ｓｃａｎ邋ｏｆ邋ｐｅｎｄｉｍｅｔｈａｌｉｎ邋ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ邋ｂｙ邋ｔｈｅ邋ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ邋ｃｕｌｔｕｒｅ．逡逑ＣＫ，邋ｂｌａｎｋ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｏｆ邋ｐｅｎｄｉｍｅｔｈａｌｉｎ；邋Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，邋ｐｅｎｄｉｍｅｔｈａｌｉｎ邋ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｔｈｅ逡逑ａｃｔｉｖａｔｅｄ邋ｓｌｕｄｇｅ．逡逑将第四代富集培养液进行梯度稀释，ｉ（ｒ４至ｉｃｒ７梯度稀释液涂布于含］00邋ｍｇ／Ｌ二逡逑甲戊灵的ＭＳＭ平板上，３０°Ｃ培养２ｄ后，分离筛选得到７株菌株，将这７株菌株单逡逑菌落分别接种至２０邋ｍＬ邋ＬＢ液体培养基中扩大培养，培养至对数后期，离心收集菌体，逡逑用新鲜的ＭＳＭ洗涤２次后重悬菌体，然后按１％邋（ｖ／ｖ）的接种量接种至含１００邋ｍｇ／Ｌ逡逑二甲戊灵的２０邋ｍＬ邋ＭＳＭ中

【参考文献】