典型全氟化合物在食物中的生物有效性及对小鼠的肝毒性、致毒机制研究

发布时间：2020-06-29 14:19

【摘要】：全氟烷基化合物(简称全氟化合物)是一类广泛应用于工业生产和日常生活的化合物,具有化学和热稳定性强,不易被生物降解的特点,具有环境持久性。与传统的持久性有机污染物不同,全氟化合物是两性分子,水溶性好,而且分子当中不含苯环,因此在环境分布、生物代谢和毒性机制上均和传统的有机污染物有所区别。研究已经证明,肝脏是全氟化合物的主要靶器官,但是目前全氟化合物的致毒机理尚不明确,对雌雄动物的毒害差异研究开展较少,对其生物有效性研究也是空白。本论文针对具有代表性的全氟化合物——全氟辛酸,使用小鼠体内模型与模拟胃肠法的体外模型对照,研究其在不同食物中的生物有效性,及食物组分对其生物有效性的影响。并对全氟辛酸和另一种人体常见的全氟化合物——全氟己烷磺酸,在雌雄小鼠体内造成的肝脏毒性进行系统研究,使用蛋白组学方法研究其致毒的分子机制。全文的主要研究内容和结果如下：对于在氟化工园区附近居民而言,全氟辛酸的主要暴露来源之一就是通过食物摄入。为此,我们对全氟辛酸的食物中生物有效性进行了测定,结果显示全氟辛酸在食物中的生物有效性远远低于通过饮水获得的暴露,油脂可以减小全氟辛酸的生物有效性。同时我们采用三种体外方法测定其生物可用性。结果显示,来自欧盟组织的UBM方法测定的生物可用性和小鼠体内实验结果最为吻合,可以作为预测食物中全氟辛酸的生物有效性的体外方法。全氟辛酸与传统有机污染物的肠道吸收模式有明显的差异,油脂分解产生的脂肪酸,可能饱和肠道的有机阴离子转运酶,造成全氟辛酸的吸收效率低下；另外在脂肪酸消化过程中,肠液的Zeta电位出现了下降,造成胶束的不稳定,引发两性化合物(如全氟辛酸和脂肪酸等)的凝絮,从而降低全氟辛酸在肠液中的浓度,进一步减少肠道吸收。前人的动物实验显示,全氟辛酸暴露于小鼠后,主要蓄积于肝脏和血液中,并引发肝毒性,但是对于全氟辛酸造成小鼠肝凋亡的机制和雌雄小鼠的毒性差异还没有深入研究。在本研究中,我们将全氟辛酸以0.05、0.5和2.5 mg/kg/day的低中高剂量分别暴露于雌/雄性小鼠28天后,最高浓度组小鼠出现体重的显著性下降。化学分析显示,全氟辛酸会蓄积在小鼠的肝脏和血液中,引发肝脏的肿大和病变的产生,肿大趋势随暴露剂量的增加而增强,在同一暴露浓度下,雌性小鼠中肝重增加更多。病理切片显示,肝脏发生肝细胞肿胀变性和过氧化物酶体增殖。出现气球样病变和嗜伊红凋亡细胞,说明出现了细胞凋亡。在0.05mg/kg/day暴露的雌性小鼠中,观察到了脂粒在肝细胞中的堆积,并通过进一步的超薄切片透射电镜观察确认。透射电镜观察还证明了中高浓度暴露组过氧化物酶体增殖。在除雄性最低剂量组外的其他组中,均观察到随剂量加深的细胞核固缩和线粒体形态变化,证实了凋亡的发生。进一步实验证明,线粒体的膜电位在出现凋亡现象的暴露组小鼠肝细胞中发生比例逐渐提高的丧失,进而引发了Caspase-9酶体的激活,造成了小鼠肝细胞的凋亡。在所有测定指标中,雌性小鼠在低浓度均较雄性更为敏感,低浓度PFOA对雌性小鼠造成的肝损伤更为严重。全氟己烷磺酸是另一种在人体中广泛检出,并具有很长代谢周期(8.5 yr)的全氟化合物,但是对其的毒理学研究还未深入展开。以相同的低中高剂量暴露于雌雄小鼠,在中高的两个暴露剂量下,小鼠均出现了体重下降的情况,全氟己烷磺酸在小鼠的血液和肝脏中积累的情况和全氟辛酸类似,但是造成的肝肿大显著弱于全氟辛酸,只在最高浓度的雌雄小鼠观察到肝脏肿大的现象。病理切片显示,只有低浓度的暴露组小鼠未发生肝脏的病变,在所有小鼠中均没有观察到显著过氧化物酶体增殖现象,只在雌性的最高暴露剂量组出现了气球样变性和肝细胞的肿大,另外虽然也观察到了脂粒在肝细胞中堆积的现象,但是只发生在雄性最高浓度组。超微结构的观察发现,过氧化物媒体增殖和凋亡现象只在中高暴露剂量下发生,且强度较弱,表明全氟己烷磺酸的肝毒性弱于全氟辛酸。进一步的实验表明,全氟己烷磺酸引发线粒体膜电位散失和Caspase-9激活的能力均弱于全氟辛酸。为了进一步理清全氟辛酸引发肝毒性的分子机制,我们使用iTRAQ技术测定了全氟辛酸暴露小鼠肝脏的蛋白组学变化,并用Western Blot验证了实验结果。结果显示,在检出并定量的～1800个蛋白中,超过三分之一的蛋白在任一暴露组均出现了表达上的显著变化,这些变化的蛋白主要集中于线粒体上,表明全氟辛酸主要通过影响线粒体的功能而发生毒理作用。雌性较雄性更为敏感,在低剂量即出现大量的蛋白变化。之前的研究认为PPARa信号通路诱导的活性氧自由基(ROS)的产生,可能是全氟辛酸引发小鼠肝细胞凋亡的关键因素。但是蛋白组结果显示,雌性在最低剂量组中,由PPARa信号通路激活的脂肪酸β氧化和ω羟基化反应相关的蛋白均未出现上调,表明PPARa信号通路并未激活。PPARa基因半定量PCR也得到同样结果,因此PPARa信号通路并不是全氟辛酸诱导凋亡的分子机制。进一步的分析显示,p53信号通路上下游的关键蛋白PDCD5和CYCS均出现了上调,表明p53通路被激活,从而引发细胞内活性氧自由基的产生,导致凋亡。通过8-脱氧鸟苷的测定,我们确认了小鼠肝细胞中出现了DNA的氧化损伤,这也是p53通路激活的主要诱因。由于p53通路具有非常强的保守性,在小鼠体内观察到的这一毒理机制,很可能也适用于人体,因此对于全氟辛酸的人体危害,我们需要针对性的采取防范措施。
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X592
【图文】：

地图,中文,正文,血液

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典型全氟化合物在食物中的生物有效性及对小鼠的肝毒性、致毒机制研究

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【参考文献】