斑马鱼abcb4和abcc4基因抗毒物积累的功能研究

发布时间：2020-07-08 11:04

【摘要】：环境污染导致重金属、藻毒素和持久性有机污染物等有毒物质在自然水体中大量积累,严重威胁鱼类和其它水生生物的生存,并可通过饮用水和食物链等渠道危害人类健康。ABCB1和ABCC4属于ABC转运蛋白超家族成员,作为多毒物耐受的主要因子,在毒物排泄、组织防御和信号传导等方面有着重要的生理学作用。研究表明斑马鱼abcb4和abcc4基因是哺乳动物ABCB1和ABCC4直系同源基因,也可能具有识别和转运多种毒物的功能。目前,对鱼类abcb4和abcc4基因在微囊藻毒素(Microcystin-LR, MC-LR)或有机氯类农药DDT和lindane解毒和排泄中的功能研究还很少。本研究克隆了斑马鱼abcb4和abcc4基因的编码序列,建立了稳定表达斑马鱼Abcb4及其显性失活体Abcb4-G1177D, Abcc4及其显性失活体Abcc4-G1188D的LLC-PK1细胞系,并研制出有效整合的转abcc4基因斑马鱼品系,为探讨过表达斑马鱼abcb4和abcc4基因在毒物解毒和排泄中的分子功能及其作用机理提供细胞和转基因动物模型。取得的研究结果如下：1.本研究证实了斑马鱼Abcb4介导LLC-PK1细胞和斑马鱼胚胎对MC-LR外排的生理功能。检测了abcb4基因在成体斑马鱼各组织中的表达情况,其中以肠道的表达量最高。MC-LR处理可显著诱导斑马鱼abcb4基因在96-hpf幼体中的转录表达。过表达斑马鱼abcb4基因能明显降低MC-LR的毒性效应及在LLC-PK1细胞和斑马鱼胚胎内的积累。其显性失活体Abcb4-G1177D没有转运功能活性,但具有与底物结合的能力,可竞争性抑制内源性斑马鱼Abcb4的功能。过表达斑马鱼Abcb4-G1177D显著降低了胚胎对MC-LR的耐受能力。此外,MC-LR也能诱导斑马鱼胚胎内ATPase活性的升高。从这些结果推测斑马鱼abcb4基因可能是环境水体中藻毒素污染的敏感基因,参与鱼类对藻毒素的解毒过程。2.DDT和lindane是一类具有剧毒的有机氯类农药,通常在一些发展中国家使用频繁,从而对生态环境和人类健康构成了严重威胁。本研究证实了斑马鱼Abcc4具有介导LLC-PK1细胞和斑马鱼胚胎对DDT和lindane外排的生理功能。研究结果显示DDT或lindane能显著诱导斑马鱼abcc4 mRNA的上调表达。过表达斑马鱼abcc4基因能大幅度增强LLC-PK1细胞和斑马鱼胚胎对DDT和lindane的耐受能力和外排能力。其显性失活体Abcc4-G1188D可竞争性抑制内源性Abcc4的功能,将其过表达后提高了DDT和lindane对LLC-PK1细胞和斑马鱼胚胎的毒性。此外,DDT或lindane处理也能显著诱导谷胱甘肽(GSH)和ATPase活性的升高。以上结果表明斑马鱼Abcc4可能是介导有机氯类农药DDT和lindane解毒和排泄的重要因子。3.本研究还采用转基因技术并结合SB (Sleeping Beauty)转座子系统研制转abcc4基因斑马鱼品系。首先构建了“全鱼”序列的转基因载体,即启动子和PolyA序列均来自鲤鱼β-肌动蛋白基因,在abcc4编码序列的终止子引入了Flag标签序列用于表达分析。PO代转abcc4基因斑马鱼阳性率为22.1%,并获得了3条可通过性腺传递的P0代阳性个体。将这3条P0代亲本分别与野生型鱼配对繁殖,F1代阳性鱼筛选的比率分别是43.75%、47.22%和52.08%。qPCR和Western Blotting结果表明有2尾F1代阳性鱼能够有效表达。通过F2代有效整合的阳性鱼自交,获得了一尾转abcc4基因纯合鱼品系。综上所述,斑马鱼abcb4和abcc4基因能被微囊藻毒素及有机氯类农药DDT或lindane诱导表达,过表达后介导多毒物耐受的生理功能,并促进LLC-PKl细胞和斑马鱼胚胎对这些有毒物质的外排。此外,通过过表达细胞系的建立,结合研制出有效表达的转abcc4基因斑马鱼品系,为后续深入开展斑马鱼Abcb4和Abcc4转运蛋白抗毒物积累排泄的功能及其作用机制提供模型。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X171.5;Q78
【图文】：

斑马鱼,成体,基因,肠道

逑眼、鲍、精巢、卵巢、肝脏、肠道、肾脏、心脏和肌肉进行了定量ＰＣＲ分析。逡逑结果显示（如图１．１），＾＾６６６４基因的转录本几乎在所检测的成体组织中都有表达，逡逑是一个泛组织表达的基因。其中以肠道和肝脏的表达量最高，其次是肌肉、鲍、逡逑眼和卵巢，在精巢、肾脏、心脏和中的表达量最低。这些结果表明斑马鱼〃６＾：６４逡逑基因可能在成体斑马鱼的某些组织或器官中（如肠道和肝脏）具有重要的生理学逡逑作用。逡逑１６０逡逑ｃ邋１４０邋■逡逑０逡逑？邋１２０邋．逡逑Ｈｉ逡逑ＣＯ逡逑１００邋？逡逑ｏ２逦Ｔ逡逑Ｉ邋§邋？逦Ｉ逡逑，卜邋Ｉ逡逑＾邋４０邋■逦■逡逑＾邋２０邋“邋■逡逑Ｑ逦－邋Ｉ逦ｔ逦ｔ逦—１＿Ｊ６Ｌ＿Ｉ＿＾Ｌ－Ｊ逡逑图１．１邋ｆｌＡｃＷ基因在成体斑马鱼各个组织中的表达情况。ｂｒａｉｎ：脑；ｅｙｅ；眼；ｇｉｌｌ：逡逑鱼思；ｈｅａｒｔ：心脏；ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ：肠道；ｌｉｖｅｒ：肝脏；ｍｕｓｃｌｅ：肌肉；ｋｉｄｎｅｙ：肾脏；逡逑ｏｖａｒｙ；卵巢；ｔｅｓｔｉｓ：精巢。所有组织都取自３尾（心脏和肾脏取自１０尾）性成逡逑熟斑马鱼的混合样品。数据以平均值±标准偏差（ｎ＝３）表示。逡逑Ｆｉｇ．１．１邋Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｚｅｂｒａｆｉｓｈ邋ａｂｃｂ４邋ｇｅｎｅ邋ｉｎ邋ａｄｕｌｔ邋ｔｉｓｓｕｅｓ．邋Ｂｒａｉｎ，逡逑ｅｙｅｓ

斑马鱼,微囊藻毒素,诱导表达,胚胎发育

ｍＲＮＡ的诱导表达。结果显示（如图Ｌ２Ｄ），Ｏ．Ｏｌ－ｌＯｎｇ／Ｌ邋ＭＣ－ＬＲ处理２４－９６ｈｐｆ逡逑斑马鱼胚胎都能显著诱导基因转录水平的表达，诱导效率依次呈１．４１，１．７９逡逑和２．１０倍递增。整体原位杂交的结果表明（如图１．２Ｅ），与对照组相比，Ｏ．Ｏｌ＾ｉｇ／Ｌ逡逑ＭＣ－ＬＲ处理能明显诱导ａｂｃｂ４基因在９６邋ｈｐｆ斑马鱼胚胎肠道中的高表达。逡逑０邋Ｏ－Ｏｆ邋０．１邋１邋Ｗ逦０逦０．０１逦１逦１０逡逑。丨Ｕ邋Ｍ逡逑０邋０．０１邋０．１邋１邋１９逦０邋０．０１邋０，１邋１邋１０逡逑ＭＣ－ＬＲ邋（Ｊｉｇ／ｔ）逦ＭＣ－ＬＨ邋（Ｍ９／Ｍ逡逑ＣＫ逦Ｉ逡逑图１．２微囊藻毒素对斑马鱼胚胎发育的影响及对ａｂｃｂ４基因的诱导表达。（Ａ）逡逑０－１邋Ｏ＾ｇ／Ｌ邋ＭＣ－ＬＲ处理２４ｈｐｆ胚胎，统计９６ｈｐｆ的出膜率。（Ｂ邋）畸形率的统计。（Ｃ邋）逡逑成活率的统计。（Ｄ）ＩＯＯ粒２４ｈｐｆ斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的ＭＣ－ＬＲ至９６ｈｐｆ，逡逑ｑＰＣＲ检测９６ｈｐｆ邋ｆｌｋｒＷ基因转录水平的表达情况。（Ｅ）整体原位杂交检测逡逑０．０１＾ｌｇ／Ｌ＾＾Ｃ－ＬＲ对斑马鱼胚胎＾７６６＾从基因组织特异性的诱导表达。ＣＫ表示未用逡逑ＭＣ－ＬＲ处理的对照胚胎，黑色箭头指示的肠道的表达信号。数据表示平均值±逡逑标准偏差，ｎ＝３。＇？表示／）＜０．０１，邋＊表示／？＜０．０５。逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ＭＣ－ＬＲ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｈａｔｃｈｉｎｇ，邋ａｂｎｏｒｍａｌ邋ａｎｄ邋ｓｕｒｖｉｖａｌ邋ｒａｔｅｓ邋ａｎｄ逡逑ｚｅｂｒａｆｌｓｈ邋ａｂｃｂ４邋ｇｅｎｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｄｅｖｅｌｏｐｉｎ

过程图,胚胎,斑马鱼,微囊藻毒素

的转运效应。将不同浓度的ＭＣ－ＬＲ和０．５＾ｉＭ邋Ｒｈ－１２３共同处理过表达ＧＦＰ、Ａｂｃｂ４逡逑和Ａｂｃｂ４－Ｇ１１７７Ｄ胚胎，２８°Ｃ避光孵育４０ｍｉｎ后酶标仪测定Ｒｌｉ－１２３在胚胎中的逡逑积累量。如图１．４Ｂ结果显示，随着培养液中ＭＣ－ＬＲ剂量的增大，过表达ＧＦＰ、逡逑Ａｂｃｂ４、和Ａｂｃｂ４－Ｇ１１７７Ｄ胚胎内Ｒｈ－１２３的含量均明显上升，当ＭＣ－ＬＲ的添加逡逑量在Ｏ．ｌ－ｌＯｎｇ／Ｌ范围内时，Ｒｈ－１２３在过表达ＡｂｃＭ胚胎中的积累量显著高于在逡逑过表达ＧＦＰ和Ａｂｃｂ４－Ｇ１１７７Ｄ胚胎中的积累量。另外，过表达Ａｂｃｂ４－Ｇ１１７７Ｄ逡逑胚胎中Ｒｈ－１２３的含量在ＭＣ－ＬＲ处于ｌ－１０＾ｌｇ／Ｌ范围内时，均显著高于过表达ＧＦＰ逡逑胚胎中的含量。这些结果表明ＭＣ－ＬＲ可能作为斑马鱼Ａｂｃｂ４新的结合底物

【参考文献】