养殖场废弃物厌氧发酵过程中反硝化功能基因变化机理研究

发布时间：2020-07-10 22:54

【摘要】：随着养殖业的快速发展,养殖场废弃物已成为农业面源污染的主要来源,对其合理处置是当前亟待解决的问题。厌氧发酵是处理养殖场废弃物的重要方式,可通过多种功能微生物协同作用产生清洁能源,发酵过程产生的沼液和沼渣还可作为有机肥施入农田实现畜禽粪便的资源化利用。氮素是农作物所必需的重要营养元素,养殖场废弃物厌氧发酵过程中反硝化微生物可将氮转化为含氮气体,影响发酵过程,降低沼液和沼渣的肥效。因此,明确厌氧发酵反硝化过程中氮素转化机理及其影响因素,对养殖场废弃物厌氧资源化利用具有重要意义。由于抗生素和重金属具有防治畜禽疾病和促生长的作用,被广泛应用于畜禽养殖业中,导致其在畜禽粪便中大量残留,对厌氧发酵中反硝化过程有一定影响。本文研究了发酵参数(温度和固体含量)、残留污染物(重金属和抗生素)和添加剂(沸石)对厌氧发酵过程中反硝化功能基因丰度、微生物群落及功能代谢的影响,分析了厌氧发酵过程中氮素转化、反硝化功能基因和微生物群落结构的关系及其影响因素,揭示了不同因素对厌氧发酵中反硝化过程影响机理,以期减少厌氧发酵过程氮素损失。取得的主要结果和结论如下:(1)中温厌氧发酵(35℃)过程中编码氧化亚氮还原酶nosZ基因的丰度较高,且发酵过程中N_2和N_2O累积排放量低于高温厌氧发酵(55℃)。Pseudomonas、Enterococcus、Petrimonas和Bacillus是发酵过程中主要的反硝化微生物,其中Petrimonas在中温发酵中丰度较高,而Bacillus在高温发酵中丰度较高。冗余分析表明,pH、温度和NH_4~+-N是反硝化微生物变化的主要驱动因子。温度改变了微生物群落共现性和发酵过程中关键微生物,高温发酵增加了微生物之间负相互作用。相较而言,中温发酵中微生物Network结构更复杂,发酵体系更稳定且氮素损失较少。(2)不同固体含量改变了厌氧发酵中微生物群落结构多样性和共现性模式,影响了关键微生物类群,湿式发酵(总固体含量=8%)中关键类群为Alistipes、Christensenellaceae、Petrimonas、Flavobacterium和Syntrophomonadaceae,而干式发酵(总固体含量=20%)中关键类群为Lutispora、Methanobacterium、Anaerocella、Caproicipro和Bacteroides。Methanobacteriaceae、Methanosarcinaceae和Methanocorpusculaceae、Methanomicrobiaceae分别是湿式发酵和干式发酵中主要产甲烷古菌,湿式发酵后期促进了乙酸营养型产甲烷途径。冗余分析表明,VFAs和pH是影响微生物变化的主要因子。PICRUSt功能预测结果表明,不同固体含量厌氧发酵中微生物群落功能代谢不同,干式发酵中反硝化和氨化过程相关酶基因丰度低于湿式发酵。(3)铜增加了厌氧发酵过程中N_2O/(N_2O+N_2)比率,对N_2O还原为N_2的过程有一定抑制作用,进而导致N_2O积累。铜改变了厌氧发酵过程中微生物群落组成,降低了厌氧发酵初期微生物群落Chao1、Shannon和Simpson多样性指数,这种作用随着铜浓度的增加而增加。发酵过程中,nirS和nirK基因对不同浓度铜的压力表现出不同的响应,高浓度铜对编码氧化亚氮还原酶nosZ基因抑制作用更明显。冗余分析可知,微生物群落变化对功能基因差异解释率最高,pH、SCOD、Bio-Cu和NO_3~--N为微生物群落变化的主要驱动因子。说明铜影响了微生物群落,从而间接改变了参与反硝化过程的功能基因丰度。(4)10 mg/kg泰乐菌素增加了N_2O排放量,同时减少了N_2的排放,说明低浓度的泰乐菌素对N_2O消耗过程的抑制作用强于N_2O产生的过程,而100 mg/kg泰乐菌素增加了N_2O和N_2的排放。Enterococcus和Pseudomonas为发酵后期10 mg/kg泰乐菌素处理中主要的反硝化菌属,Halomonas在100 mg/kg泰乐菌素处理中丰度显著增加,说明厌氧发酵中反硝化微生物对不同浓度泰乐菌素的响应不同。反硝化功能基因、抗生素抗性基因、整合子基因和微生物群落的共现性表明,反硝化功能基因与抗生素抗性基因可能位于同一潜在宿主菌中,并通过整合子基因进行传播,IntI1在基因水平转移中起重要作用。(5)在一定范围内,高浓度沸石(5%)能够有效削减发酵产物中抗生素抗性基因,降低重金属生物有效性。16S rRNA测序结果表明,沸石增加了微生物群落Chao1、Shannon和Simpson多样性指数,改变了微生物群落结构,增加了发酵产物中Spirochaetes和Fibrobacteres丰度。实时定量PCR结果表明,5%沸石添加量显著增加了厌氧发酵产物中nosZ基因丰度,会降低发酵产物后续资源化利用过程中N_2O排放潜力。冗余分析表明,VFAs、pH、NO_3~--N和Bio-Cu是引起反硝化功能基因差异的主要环境因子。综上所述,温度和固体含量改变了发酵过程中微生物群落共现性模式和关键微生物类群,中温发酵氮素损失较少,干式发酵中反硝化和氨化过程代谢活性低。铜改变了微生物群落结构,进而影响反硝化基因,抑制了N_2O还原过程。泰乐菌素增加了反硝化基因与抗生素抗性基因在物种间的水平转移,导致了厌氧发酵过程中较高的氮素损失。添加5%沸石能有效减轻抗生素和重金属危害,减少发酵产物中N_2O排放潜力。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S216.4;X713
【图文】：

过程图,氮素循环,过程

图 1-1 氮素循环过程Figure 1-1 Microbiology of nitrogen cycle硝化过程包括氨氧化和 NO2-氧化两个相互独立的过程。有氧条件下，好氧氨氨氧化酶催化完成（Prosser and Nicol 2008）。Maeda et al.（2010）利用 DG好氧堆肥过程中微生物群落，结合测序比对结果发现， Nitrosomonas 是堆肥束过程中的优势硝化菌。厌氧条件下，则是通过联胺氧化还原酶（hzo 基因编进行，该反应将 NH4+ N 和 NO2- N 作为底物，生成 N2和 H2O，这个过程氨氧化过程。目前厌氧氨氧化方面的研究，主要是在海洋和陆地生态系统及系统（Huet al.2011；Schmidetal.2007），已发现的厌氧氨氧化微生物均隶属门（Zhu et al. 2010）。固氮过程是指固氮微生物将环境中的氮气（N2）转化为氨（NH3/NH4+）的过ifH 基因编码固氮酶催化完成（DosSantosandDean2011）。普遍认为固氮功能于原核生物，存在于100多个细菌和古菌属，大部分属于变形菌门（Proteobact细菌门（Cyanobacterial）。有学者研究了轮作对滩涂土壤固氮群落结构的影响

电子理论,反硝化

图 1-2 传统和现代反硝化电子理论差异（Pan et al. 2013a）Figure 1-2 Electron competition in the microorganism of denitrification硝化作用酶系及相关功能基因还原酶，催化硝酸盐还原为亚硝酸盐的过程。包括由 narG 基因编原酶（NAR）和由 napA 基因编码周质硝酸盐还原酶（NAP），而 N亚基，分别由 napA 基因（为催化亚基）、napB 基因（含有细胞色素t 2002）。位于膜内 NAR 对氧分子敏感，较高的 O2浓度对它有显著细胞周质的硝酸盐还原酶 NAP 的表达对氧分子不敏感。过程中的关键步骤是亚硝酸盐还原为一氧化氮，亚硝酸盐还原酶（的限速酶，易受 NO3-诱导和 O2抑制，由 nirS 编码的 Cyt cd1 型 nirK 编码的 Cu 型亚硝酸盐还原酶催化的（Fan et al. 2015）。亚硝被用作自然界反硝化的分子标记，揭示多种生态位中种群结构的多l.（2000）利用 nirS 及 nirK 基因表征反硝化功能微生物的多样性，代分子生态学的发展和及其在环境微生物研究中的应用，为利用特相似生理功能的微生物群落提供了新的模式和途径。有学者研究了

技术路线图

【相似文献】