转bphC苜蓿—乳化蛋白AlnA联合修复多氯联苯污染土壤研究

发布时间：2020-07-15 01:32

【摘要】：多氯联苯（Polychlorinated Biphenyls，PCBs）是一类人工合成的环境异源物质，由于其在环境中难降解性及具有生物富集性，已被《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》列为12种持久性有机污染物（Persistent Organic Pollutants，POPs）之一。PCBs虽已被禁止生产，但已造成“全球性的环境污染”。PCBs的植物修复技术，具有低成本、应用性强、对环境友好、可最大程度保持土壤基本性质不变等特点，是最具有应用前景的修复技术。但是植物修复技术受PCBs对植物生长毒害作用及土壤中PCBs生物可利用性低等因素的限制，在实际场地修复中，效果往往达不到预期。因此，本研究拟利用转bphC苜蓿联合乳化蛋白AlnA修复PCBs污染的土壤，研究转基因苜蓿对PCBs的耐受性；分析AlnA能否提高PCBs的生物可利用性；阐明转基因苜蓿-乳化蛋白AlnA联合修复PCBs污染的土壤效能。 （1）亚克隆来源于土壤宏基因组的2,3-二羟基联苯双加氧酶基因（bphC），构建其植物表达载体。利用农杆菌介导的方法，遗传转化于苜蓿，通过草胺膦的抗性筛选，获得了10株苜蓿转化株系。并采用无性繁殖的方法进行扩繁，用于后续转基因株系的鉴定研究。通过PCR方法和western blot等分子生物技术检测苜蓿转化株系，结果表明bphC基因已经整合进入6株转基因苜蓿株系，并在植株体内表达。 （2）通过对联苯的抗性筛选、转基因苜蓿体内bphC酶活检测，确定转基因苜蓿株系BB11对PCBs的耐受性最强。采用水培法，研究转基因苜蓿对混合PCBs的耐受性，结果表明转bphC苜蓿对混合PCBs的耐受指数为88%，与野生型苜蓿（仅为54%）相比，提高了34%。通过比较分析转基因和野生型苜蓿体内PCBs含量研究发现：转基因苜蓿和野生型苜蓿都能吸收和输导PCBs，但是转基因苜蓿体内PCBs含量显著低于野生型苜蓿，说明转基因苜蓿对PCBs降解效率显著高于野生型苜蓿。因此，在后续的实验中以转bphC苜蓿BB11作为实验材料。 （3）从抗辐射不动杆菌（Acinetobacter radioresistens）中克隆AlnA基因，构建原核表达载体，在IPTG诱导下，AlnA蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达，通过镍柱纯化和western blot奠定，获得纯化的AlnA蛋白。AlnA蛋白具有表面活性，CMC值为1.07g/L (≈0.03mM)。 AlnA蛋白对不同氯原子数取代PCBs同系物都具有增溶活性，其中对四氯代的PCB52增溶活性最强。乳化蛋白AlnA虽能吸附于土壤，但是对土壤中的PCBs具有较强的解吸能力，其解吸能力与氯原子的取代数目没有相关性，对四氯代PCB52的解吸效率达74%。并且AlnA蛋白能促进苜蓿吸收土壤中的PCBs， AlnA蛋白的添加量与植物组织中PCBs的浓度成正相关。苜蓿不仅能吸收PCBs，也能将PCBs运送到地上部分，其中PCB28在苜蓿地上部分的浓度最高，说明苜蓿对其运输能力最强。 通过3D建模和分子拼接的方法，研究AlnA蛋白对PCB同系物的增溶机制。根据分子对接和溶解活性研究结果分析，AlnA蛋白对PCBs的溶解机制与结合能，结合簇及能量构象密切相关。AlnA蛋白为非特异性的生物表面活性剂，PCBs可与AlnA蛋白不同结合位点结合，形成多重构象。利用盲目对接手册研究表明：高氯代的PCBs（PCB28,52和101）与AlnA蛋白有较强的亲和力。7种PCBs同系物都与AlnA蛋白具有典型的β-桶状结构结合。不同的PCB同系物与AlnA蛋白之间存在着不同的结合位点，这也受到PCBs分子的空间位阻和电子云分布的影响。 （4）利用盆栽实验，研究转bphC基因苜蓿联合乳化蛋白AlnA对PCBs污染土壤的修复效能。实验结果表明，转bphC基因苜蓿-乳化蛋白AlnA联合修复PCBs污染土壤的效能最高。转基因苜蓿的株高、鲜重及叶片的叶绿素（B处理）含量等生理指标均高于野生型苜蓿，表明转基因苜蓿对PCBs的耐受性显著高于野生型苜蓿；但是当添加AlnA乳化蛋白，转基因苜蓿的生理指标与野生型苜蓿相当，说明转基因苜蓿的生长受到抑制。这可能是乳化蛋白AlnA提高了土壤中PCBs的生物可利用性，使转基因苜蓿体内的PCBs含量显著提高（A处理），进而对其生长产生一定的抑制作用。 在PCBs的胁迫下，不同处理中土壤酶活性差异显著，而且与未栽培苜蓿的对照相比，苜蓿的栽培可显著提高土壤中的脱氢酶、过氧化氢酶和多酚氧化酶的活性。尤其是只种植转基因苜蓿（B）处理中土壤的这三种酶的活性最强，说明植物的生长性状与土壤微生物的活性密切相关。土壤中PCBs降解基因bphC丰度研究结果表明：转基因苜蓿与乳化蛋白AlnA联合修复PCBs污染土壤效能的提高，与PCBs降解基因丰度的增强密切相关。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X53
【图文】：

汁丝孢酵母（Trichosporon mucoides）和酿酒酵母（Saccharomy cescerevisiae）；白腐菌有黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium），Phlebia brevispoTMIC33929 ，糙皮侧耳（ Pleurotus ostreatus ），朱红密孔菌（ Pycnoporcinnabarinus）和粗毛栓菌（Tramete sversicolor），还有外生菌根真菌（Gautiercrispa），灰树花（Grifola frondosa），菌根真菌（Radiigera atrogleba）和尖端赛多孢子菌（Scedosporium apiospermum）等真菌。与细菌降解相比，真菌降解途径具有很多优点。真菌降解系统是由自由基攻击介导，具有较低特异性，并且这个反应是在真菌胞外完成。因此真菌降解系统能降解底物范围宽泛的芳烃化合物。另外，一些真菌菌株与植物的根之间具有共生关系，形成内生菌根和外生菌根；这种共生关系促进了真菌的生长，使它们抗性增强（Donnelly & Fletcher，1995）。但是真菌对 PCBs 比较敏感，不能耐受高浓度的 PCBs，初始的 PCBs 浓度越高可能会导致对其降解能力下降（Murado et al., 2002；Ruiz-Aguilar et a2002 ；Field et al., 2008；Hickey, 1996； Ruiz-Aguilar et al., 2002）。

又将最后反应一步分为两个独立的阶段，一是只将产物局限于运中，而第二步是最终反应（与细胞壁结合或排泄）（Theodoulor, 2007）。物代谢 PCBs 一般形成水溶性更强的羟基氯代联苯（Mackova et a et al.，1995；Kuˇcerová et al.，2000；Rezek et al.，2009）。不同实明植物细胞能将一氯代和二氯代 PCB 羟基化，但是也有特例，同苯的 4,4′-二氯代联苯却不能被羟基化，可能是有由于结构保护作酶的进攻，而 2,4,4′-三氯代联苯却可以被羟基化（Kuˇcerová et a et al.，2003；Harms et al.，2003）。进一步研究发现植物细胞能代的二氯、三氯和四氯代同系物，Harms 等（2003）报道 3,3′,4,4′-蔷薇科和莴苣氧化成单羟基的中间代谢产物。同样 2,2′,5,5′-四氯 3,4-二羟基-2,2′,5,5′-四氯代联苯。

因此，转基因植物分泌的解毒酶有利于根际修复更广泛的疏水化学物质。提高转基因植物的根际修复可能是 PCBs 污染原位修复有效方法之一。图1.3 根际区域与修复效能相关的酶和微生物活动示意图（Abhilashetal.,2009）Fig. 1.3 Schematic representation of the enzymatic and microbial activities responsiblefor the enhanced remediation in rhizospheric zone（Abhilash et al., 2009）.1.2.4.4 加入表面活性剂现已公认，生物可利用性是限制 PCBs 生物修复的重要因素之一。在受污染18

【参考文献】

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本文编号：2755775