取代脲类除草剂微生物降解关键酶基因pdmAB与ddhA的克隆表达及功能验证
发布时间：2020-07-21 08:21
【摘要】：自上世纪中期被推入市场以来,取代脲类除草剂在世界范围内被广泛施用,成为除草剂大家庭中一个重要成员。然而,随着该类除草剂的持续施用,其残留的环境危害也逐渐凸显,取代脲类除草剂及其代谢产物被证明对微生物、植物、动物及人类都有毒害作用。因此,取代脲类除草剂的吸附、迁移和分解等环境行为备受关注。在自然条件下,微生物在该类除草剂的降解过程中发挥着主要作用,所以,取代脲除草剂的微生物降解及其分子机理是研究的热点。根据苯环上取代基差异,取代脲类除草剂可分为N,N二甲基取代脲类除草剂和N-甲氧基-N-甲基取代脲类除草剂两类。目前,已报道有几十株能降解取代脲类除草剂的微生物,且能够矿化N-甲氧基-N-甲基取代脲类除草剂的微生物主要来自Variovorax属细菌,而能够矿化N,N-二甲基取代脲类的则都是sphingomonads(属Sphingomonas、Novosphingobium、Sphingopyxis和Sphingobiu 被统称为 sphingomonads)。Variovorax属细菌矿化N-甲氧基-N-甲基取代脲类的途径和分子机理已经被阐明,sphingomonads矿化N,N二甲基取代脲类的途径基本清楚,但相关分子机理还处于空白。在前期的工作中,本实验室分离到一株能够矿化N,N-二甲基取代脲的菌株Sphingobium sp.YBL2,该菌降解N,N-二甲基取代脲类的途径为:依次从N基团上脱甲基,继而是脲桥的断裂,最后生成的苯胺化合物开环降解。本论文主要以菌株YBL2以及N,N-二甲基取代脲类除草剂的代表异丙隆(IPU)为研究材料,阐明了 sphingomonads矿化N,N-二甲基取代脲类除草剂的分子机理。具体工作可分为以下三个方面。一、Sphingobium sp.YBL2中脱甲基酶基因pdmAB的克隆及功能验证研究表明,YBL2等微生物对N,N-二甲基取代脲类除草剂降解的起始步骤是脱甲基,该步骤被认为是底物降解的限速步骤。本研究利用转座子随机插入突变的方法构建文库,从YBL2中克隆到基因pdmAB。PdmAB能够将N,N-二甲基取代脲类除草剂脱一个甲基。比对后发现,PdmAB是Rieske非血红素铁加氧酶系统(ROs)中加氧酶组分,其中pdmA编码α亚基,pdmB编码β亚基。pdmAB被两个序列完全相同的转座酶基因包围,在从不同地区分离的取代脲类降解菌中这一转座单元高度保守。ROs通常由加氧酶组分和电子传递链组分组成,序列分析发现在加氧酶PdmAB基因周围没有电子传递链组分。将PdmAB在大肠杆菌、假单胞菌和其它的sphingomonads中表达都检测到了异丙隆的降解活性。两个[3Fe-4S]-type的铁氧化还原蛋白(一个来自于RW1的Fd34-1和一个来自于YBL2的Fd2750)分别与PdmAB在大肠杆菌中共表达,显著的提高了 PdmAB的活力。上述结果表明,PdmAB对电子传递链组分的需求不是特异性的,并且其对应的铁氧化还原蛋白应是[3Fe-4S]-type。PdmA与先前已经报道的加氧酶的α亚基同源性较低(37%),系统发育树分析发现其不与催化O-和N-上脱甲基的加氧酶成一簇,表明PdmAB是一个新的脱甲基酶。二、水解酶基因ddhA的克隆、表达及其酶学特性的研究通过对野生型菌株YBL2和突变株YBL2-Mut全基因组测序比对,我们成功的克隆到了 DDIPU的水解酶基因,命名为ddhA。基因ddhA含有2139个碱基,编码712个氨基酸,G+C含量为47.5%。将基因ddhA在NCBI核酸数据库中比对,未发现与ddhA同源的DNA序列。比对后发现,在已报道的蛋白序列中,DdHA仅与来自于西维因降解菌Rhizobium sp.AC100的水解酶CehA(BAB85626)有一定的同源性,为14%。通过亲和层析对融合蛋白进行纯化。SDS-PAGE分析发现,DdhA大小约80kDa。通过HPLC和MS/MS方法,鉴定了 DdhA催化1-对异丙基苯基脲(DDIPU)水解的产物为对异丙基苯胺(4IA)。酶学特性研究结果表明DdhA的最适酶促反应温度为35℃,最适pH为7.0,1 mM的Hg2+、Cu2+和Zn2+能强烈抑制DdhA的酶活。同时我们也研究了 DdhA的底物谱。结果表明DdhA除了可以降解DDIPU外,还可以降解1-(4-异丙基苯基)-3-甲基脲(MDIPU)和对氯苯基脲,产物分别为4IA和对氯苯胺。DdhA能够直接降解MDIPU,说明在YBL2降解异丙隆的过程中,生成的中间代谢产物MDIPU可能有两条路径代谢:一是进一步的脱甲基生成DDIPU;另一条代谢途径就是直接断脲桥生成4IA。这一结果表明,在YBL2降解异丙隆的过程中,DdhA主要是负责催化中间代谢产物MDIPU和DDIPU脲桥的断裂,PdmAB和DdhA一起作用可以将异丙隆转化成苯胺的衍生物。对氯苯基脲与DDIPU结构类似,为取代脲除草剂灭草隆的两步脱甲基产物,DdhA能够降解对氯苯基脲,结合在几株异丙隆降解菌株中该基因高度保守这一特性,说明DdhA可能是微生物以典型途径降解N,N-二甲基这一类取代脲除草剂的关键基因,对此类除草剂的降解有重要的理论意义。同时我们还发现,DdhA能够降解氨基甲酸类除草剂西维因和呋喃丹,生成产物分别为α-萘酚、呋喃酚。三、取代脲类除草剂降解菌株的分离鉴定及其降解异丙隆和利谷隆的代谢途径本研究还通过富集培养的方法,从长期生产取代脲类除草剂工厂的污泥中分离筛选出一株能够同时降解N,N-二甲基取代脲类除草剂异丙隆和N-甲氧基-N-甲基取代脲除草剂利谷隆的菌株,命名为Pu21。经形态、生理生化特性测定及其16S rRNA基因序列和系统进化树的分析,该菌株被鉴定为Sphingobium.sp.。到目前为止,已报道的取代脲除草剂的降解菌株很多,但是能够同时且高效降解两类除草剂的菌株鲜有报道。通过连续取样,经HPLC和MS/MS分析,鉴定了菌株降解异丙隆和利谷隆的代谢途径。菌株对异丙隆的降解首先是通过一步的脱甲基生成MDIPU,MDIPU可以脱甲基生成DDIPU,DDIPU断脲桥生成4IA,MDIPU也可以直接断脲桥生成4IA,生成的4IA可以进一步的降解。对利谷隆的降解则是直接断脲桥,生成的3,4-DCA在代谢过程中没有积累,也能够被菌株继续降解。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：X592;X172
【图文】：
取代尒类除草剂微生物降解关键酶基因ｐ如与的克隆表达及功能验证亚基；？＜办７＾的敲除逡逑疑似的基因进行敲除，Ｗ验证其与异丙隆降解的关系。ＷＹＢＬ２的基，利用引物ＱＣＦ／ＱＣ民扩X棾ざ任澹担矗冲澹猓鸬耐幢郏ㄈ缤迹欤担粒廖埠罅拥剑校停模保梗陨希羧⊙粜钥寺∽樱崛≈柿＃穑裕眩缅澹ㄈ缤剂：椭柿＃校剩眩玻埃埃樱送庇孟拗菩阅谇忻腹幔恚椋焙停妫祝伤盖泻螅粒牛悖铮ⅲ停保傲校粞⊙粜钥寺∽樱崛≈柿＃穑剩眩模铃澹ㄍ迹校茫一蛎盖醒橹ぁｅ义希湾澹卞危湾澹卞危插澹冲澹村义
本文编号：2764157
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：X592;X172
【图文】：
取代尒类除草剂微生物降解关键酶基因ｐ如与的克隆表达及功能验证亚基；？＜办７＾的敲除逡逑疑似的基因进行敲除，Ｗ验证其与异丙隆降解的关系。ＷＹＢＬ２的基，利用引物ＱＣＦ／ＱＣ民扩X棾ざ任澹担矗冲澹猓鸬耐幢郏ㄈ缤迹欤担粒廖埠罅拥剑校停模保梗陨希羧⊙粜钥寺∽樱崛≈柿＃穑裕眩缅澹ㄈ缤剂：椭柿＃校剩眩玻埃埃樱送庇孟拗菩阅谇忻腹幔恚椋焙停妫祝伤盖泻螅粒牛悖铮ⅲ停保傲校粞⊙粜钥寺∽樱崛≈柿＃穑剩眩模铃澹ㄍ迹校茫一蛎盖醒橹ぁｅ义希湾澹卞危湾澹卞危插澹冲澹村义
本文编号：2764157
本文链接：https://www.wllwen.com/shengtaihuanjingbaohulunwen/2764157.html
