产絮菌的差异表达蛋白质及其功能解析研究

发布时间：2020-07-21 14:07

【摘要】：生物絮凝剂作为一种高效、无毒、无二次污染、具有生物可降解性和安全性的绿色水处理剂,代表了絮凝剂的重要研发方向之一,可广泛应用于给水和废水处理领域。复合型生物絮凝剂(CBF)是本实验室开发的一种高效生物絮凝剂,经过两段式发酵生产,产絮菌群由高效产絮菌F2和F6构建,产絮菌F2、F+(F2与F6混合培养)产生的生物絮凝剂主要活性成分为胞外分泌的多糖类物质。本研究从蛋白质组学角度研究产絮菌产絮过程差异表达蛋白质及其功能调控,从分子水平研究产絮菌的产絮机理,提出工业化生产生物絮凝剂的调控策略。 首先,比较在基本培养基和产絮培养基培养条件下产絮菌所产生的生物絮凝剂在产量、成分上的差别,与基本培养基培养条件下相比,在产絮培养基培养条件下,产絮菌F2、F6会形成一些差异表达蛋白质,这些差异表达蛋白质是导致在产絮培养基培养条件下,诱导和产生大量生物絮凝剂主要活性成分多糖的直接原因。 然后,利用SDS-PAGE、2-DE和质谱结合的蛋白质组学研究手段对产絮菌F2、F6在基本培养基和产絮培养基不同培养条件下差异表达蛋白质进行分离、鉴定和功能解析。通过SDS-PAGE,研究在基本培养基和产絮培养基培养条件下,产絮菌F2、F6总蛋白的变化情况,共鉴定出58个产絮菌F2产絮过程差异表达蛋白质,14个产絮菌F6产絮过程差异表达蛋白质。通过2-DE,研究在基本培养基和产絮培养基培养条件下,产絮菌F2可溶性总蛋白的变化情况,共有28个产絮菌F2产絮过程差异表达蛋白质点得到成功鉴定。通过对产絮菌产絮过程差异表达蛋白质的功能解析,从蛋白质组学层面揭示了产絮菌的产絮机理。 最后,利用多项摇瓶试验,进行产絮菌生产生物絮凝剂的相关调控规律研究,建立起发酵条件,差异表达蛋白质的功能和产絮变化三者之间的关系,对工业上生产生物絮凝剂提出底物水平调控、发酵过程参数、菌种复壮三个层面的调控策略。 本研究从蛋白质组学层面研究产絮菌的产絮机理,为全面解析和调控产絮菌产絮代谢途径奠定坚实的理论基础。基于产絮菌产絮过程差异表达蛋白质的功能解析,提出工业化生产生物絮凝剂的调控策略,为提高生物絮凝剂产量,调控生物絮凝剂工业化生产起到重要的指导作用。
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：X703.5
【图文】：

生物絮凝剂粗提物，先称重，再进行红外光谱测定。产絮菌 F+的生物絮凝剂粗提物与以上 F2 的操作相同。3.3.1 生物絮凝剂粗提物的产量图 3-1 是相当于从 100mL 培养基中发酵获得的生物絮凝剂粗提物的图片，图 3-1a)表示接菌 F2 共 3 环到 100mL 基本培养基中，摇床中 140rpm，30℃培养 24h，用乙醇提取，将提取物溶解，用真空冷冻干燥器获得的生物絮凝剂粗提物；图 3-1b)接菌 F2 共 2 环，1 环 F6 到 100mL 基本培养基中，摇床中 140rpm，30℃培养 24h，用乙醇提取，将提取物溶解透析，用真空冷冻干燥器获得的生物絮凝剂粗提物；图 3-1c)表示接菌 F2 共 3 环到 100mL 产絮培养基中，摇床中140rpm，30℃培养 24h，用乙醇提取，将提取物溶解，用真空冷冻干燥器获得的生物絮凝剂粗提物；图 3-1d) 接菌 F2 共 2 环，1 环 F6 到 100mL 产絮培养基中，摇床中 140rpm，30℃培养 24h，用乙醇提取，将提取物溶解透析，用真空冷冻干燥器获得的生物絮凝剂粗提物。以上试验取 3 个不同产絮菌批次，每个批次做 3 个平行样。

絮菌 F2 的琥珀酰聚糖生物合成途径基因 exoL 的研究究表明，产絮菌 F2 为根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)[93杆菌能产琥珀酰聚糖[105-107, 138]，最高产量可达 30g/L[107]。2001 年菌 C58 菌株被全基因组测序[97, 98]，通过在 NCBI 上对测序结果进 22 个 exo 基因参与琥珀酰聚糖生物合成途径。exoL 基因是根瘤土生琥珀酰聚糖生物合成途径中的一个关键基因，exoL 基因的产物是移酶[139]。本研究通过 NCBI 查找与 F2 菌株同为根瘤土壤杆菌的 CL 基因序列，根据 C58 菌株的 exoL 基因序列，利用 Primer PREMIE计引物，从 F2 基因组中直接扩增 exoL 基因的核心序列，从而从基产絮菌 F2 含有琥珀酰聚糖生物合成途径基因。F2 基因组DNA提取结果用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 F2 基因组 DNA 提取结果，如图 3-5 所1 2 31 2

絮菌 F2 的琥珀酰聚糖生物合成途径基因 exoL 的研究究表明，产絮菌 F2 为根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)[93杆菌能产琥珀酰聚糖[105-107, 138]，最高产量可达 30g/L[107]。2001 年菌 C58 菌株被全基因组测序[97, 98]，通过在 NCBI 上对测序结果进 22 个 exo 基因参与琥珀酰聚糖生物合成途径。exoL 基因是根瘤土生琥珀酰聚糖生物合成途径中的一个关键基因，exoL 基因的产物是移酶[139]。本研究通过 NCBI 查找与 F2 菌株同为根瘤土壤杆菌的 CL 基因序列，根据 C58 菌株的 exoL 基因序列，利用 Primer PREMIE计引物，从 F2 基因组中直接扩增 exoL 基因的核心序列，从而从基产絮菌 F2 含有琥珀酰聚糖生物合成途径基因。F2 基因组DNA提取结果用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 F2 基因组 DNA 提取结果，如图 3-5 所1 2 31 2

【参考文献】

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本文编号：2764519