来源于假单胞菌的甲基对硫磷水解酶OPHC2功能与结构关系的研究

发布时间：2020-07-26 16:37

【摘要】：常用于化学杀虫剂的有机磷化合物,它可以破坏乙酰胆碱酯酶的活性,导致乙酰胆碱的堆积,从而引发一系列神经中毒症状,甚至死亡。同时,有机磷农药的广泛应用造成的环境污染也是不容忽视的。甲基对硫磷水解酶是一类可以破坏有机磷分子的磷酯键,最终使有机磷化合物毒性消失的酶。它属于p内酰胺酶家族,最适作用底物是甲基对硫磷。目前,关于这类酶功能和结构方面的研究较少。因此,本研究就甲基对硫磷水解酶OPHC2耐热性以及底物特异性与其结构之间的关系进行了研究和探索。 甲基对硫磷水解酶OPHC2与同类酶相比,具有优良的耐热性。序列比对和三维结构模型分析在该蛋白中存在两个半胱氨酸(Cys110和Cys146),他们的硫原子之间的距离仅为2.03A,可能形成一个二硫键。还原条件下的SDS-PAGE电泳和DTNB滴定实验结果都证实了这个二硫键确实存在。因此,为了探索这个二硫键是否与OPHC2的热稳定性相关,我们构建了四个突变体C110L、C110A、C146A和C146M。通过酶学性质比较分析,结果发现四个突变体的热稳定性都比OPHC2差,他们在60℃和70℃的半衰期只有原酶的50%。并且,内源荧光光谱分析表明突变后酶蛋白的三维结构发生了变化,这些都说明了二硫键的存在对于维持OPHC2构象稳定性具有重要作用,它也是OPHC2具有良好热稳定的关键因素之一。 有机磷农药种类繁多,甲基对硫磷水解酶OPHC2对其中一些农药水解效果明显,如甲基对硫磷、甲基对氧磷等。但是,对于一些其他底物(如对硫磷、对氧磷)水解能力较差,是什么因素影响了它的底物的选择性,是否可以通过理性设计的突变获得具有广泛水解能力的甲基对硫磷水解酶是这部分研究的重点。我们采用了组合活性位点饱和实验(CAST)的策略,选择了五组氨基酸进行饱和突变,分别是A组(M188/M191),B组(L250/N251),C组(E168/F171),D组(E264/F265),E组(V55/L57)。通过筛选突变体库,共得到了五株对乙基对硫磷水解能力提高的突变体,其中A1-5(M188L/M191S)和E-6(L57V)最好,再将这两个突变体的突变位点进行组合突变,最终获得突变体AE (M188L/M191S/L57V)。将这三个突变基因转入酵母表达系统进行表达,测定重组酶酶学性质,结果表明A1-5、E6和AE重组酶对乙基对硫磷的水解能力(kcat/Km)分别是OPHC2的2.7倍、3.3倍和4.2倍。经过软件模拟及比较OPHC2和突变酶结构,推测第57位、第188位和第191位的氨基酸突变后使酶蛋白与底物结合口袋空间增大,更利于酶蛋白结合和催化侧链集团较大的乙基对硫磷。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士后
【学位授予年份】：2010
【分类号】：X172

【参考文献】

相关期刊论文 前9条

1 吴穗洁;吴文林;刘斌;;嗜热酶耐热机制及提高酶热稳定性的研究进展[J];亚热带农业研究;2006年04期

2 丁彦蕊;蔡宇杰;须文波;;氢键与蛋白质耐热性关系的研究[J];计算机与应用化学;2007年05期

3 刘阳,刘玉焕,陈志仕,廉婕,罗维佳,黄晓,钟英长;米曲霉LY-128广谱有机磷农药水解酶的纯化和鉴定[J];菌物系统;2003年04期

4 张红缨,孔祥铎,张今;蛋白质工程的新策略——酶的体外定向进化[J];科学通报;1999年11期

5 伍宁丰,邓敏捷,史秀云,梁果义,姚斌,范云六;一种新的有机磷降解酶的分离纯化及酶学性质研究[J];科学通报;2003年23期

6 付石军;孙建义;;改善植酸酶热稳定性的策略[J];中国饲料;2007年14期

7 刘玉焕,钟英长;华丽曲霉Z_(58)有机磷农药降解酶的纯化和性质[J];微生物学报;2000年04期

8 陈亚丽,张先恩,刘虹,王银善,夏祥明;甲基对硫磷降解菌假单胞菌WBC-3的筛选及其降解性能的研究[J];微生物学报;2002年04期

9 楚晓娜,张先恩,陈亚丽,刘虹,宋冬林;假单胞菌WBC-3甲基对硫磷水解酶性质的初步研究[J];微生物学报;2003年04期

相关硕士学位论文 前1条

1 吴旭平;邻单胞菌M6甲基对硫磷水解酶催化特性的研究[D];南京农业大学;2005年

本文编号：2771013