酵母对铅和铬胁迫的信号响应机制及吸附作用研究

发布时间：2020-07-26 20:45

【摘要】：随着工业快速发展,环境中铅(Pb)、六价铬(Cr(Ⅵ))含量急剧升高,对人类、动植物和微生物均造成了大量毒害,因此,Pb、Cr(Ⅵ)毒性机制已在世界范围内引起了广泛关注。但是,目前关于Pb、Cr(Ⅵ)毒性机制研究主要集中在动植物方面,关于Pb、Cr(Ⅵ)对微生物的毒性机制研究甚少。微生物在促进物质循环,调节植物生长,治理环境污染等方面起着重要作用,因此阐明Pb、Cr(Ⅵ)胁迫微生物的毒性机制,从而提出提高微生物对重金属胁迫的耐受性和增强微生物对重金属去除能力的具体措施,对环境保护具有重要的现实意义和理论价值。因此,本研究以模式生物酵母细胞为研究对象,研究了Pb,Cr(Ⅵ)对酵母细胞的毒性作用和毒性机制;金属硫蛋白过表达对Pb,Cr(Ⅵ)毒性效应的影响以及转金属硫蛋白(MT)酵母菌分别对电镀废水中Cr(Ⅵ)和含铅废水中Pb的去除效果。研究结果如下:1.浓度0~100 mg/L硝酸铅可抑制酵母细胞生长,降低酵母细胞活性,诱导酵母细胞死亡,随着Pb浓度升高和作用时间延长,酵母细胞死亡率逐渐增高,而泛caspase抑制剂Z-Asp-CH2-DCB可降低Pb诱导的酵母细胞死亡。同时,Pb胁迫酵母细胞死亡过程中,胞内活性氧(ROS)和Ca~(2+)水平显著升高,线粒体膜电位显著下降,胞质内细胞色素c(cyt c)含量明显增高;用1 mM抗坏血酸(AsA)可明显降低Pb引发的酵母细胞死亡,0.5 mM钙离子螯合剂EGTA或0.1 mM质膜Ca~(2+)通道特异性抑制剂LaCl_3亦可明显抑制Pb诱导的酵母细胞死亡。另外,加入AsA还能降低Pb处理组胞内Ca~(2+)水平。结果表明Pb诱发酵母细胞死亡与胞内ROS和Ca~(2+)水平升高有关,ROS可介导胞内Ca~(2+)浓度升高,高浓度Ca~(2+)可能通过诱导线粒体膜通透性转变孔道开放,或者高水平ROS致线粒体膜损伤,导致线粒体膜电位下降,开放线粒体膜通透性转变孔并释放cyt c,继而激活相关下游信号导致细胞死亡。一氧化氮(NO)作为生物体内重要的内源性信号分子,参与多种非生物胁迫响应,并在细胞死亡过程起着重要调节作用,为了阐明NO在Pb诱导酵母细胞死亡中的作用,我们检测了Pb对胞内NO水平的影响。研究发现Pb胁迫酵母细胞过程中,胞内NO水平显著升高。一氧化氮合酶抑制剂(L-name)和NO清除剂(cPTIO)能明显缓解Pb对细胞毒性,而外源NO供体硝普钠(SNP)能增加Pb对细胞毒性。为进一步调查NO在Pb诱导细胞死亡过程中的调控机制,随后我们检测了胞内一氧化氮对酵母细胞中Pb含量的影响。研究发现,在Pb诱导酵母细胞死亡过程中,L-name和cPTIO能明显降低酵母细胞中的Pb含量。相反,SNP能提高酵母细胞中的Pb含量。基于这些研究,我们认为NO可能通过调节胞内的Pb含量变化来调节酵母细胞死亡。综上所述,Pb诱导酵母细胞死亡过程中,一方面通过诱导胞内ROS和Ca~(2+)水平升高,高浓度Ca~(2+)可能通过诱导线粒体膜通透性转变孔道开放,或者高水平ROS可能损伤线粒体膜,导致线粒体膜电位下降,cyt c释放,继而激活下游相关信号导致细胞死亡;另一方面通过内源性NO调节胞内Pb含量变化诱导酵母细胞死亡。2.浓度0~7 mM Cr(Ⅵ)可抑制酵母细胞生长,诱导酵母细胞死亡,随着Cr(Ⅵ)浓度提高和作用时间延长,酵母细胞死亡率逐渐增高。同时,Cr(Ⅵ)胁迫酵母细胞死亡过程中,胞内活性氧,钙离子和一氧化氮水平明显升高,线粒体膜电位明显下降;用1 mM AsA或200 U CAT能明显缓解Cr(Ⅵ)引发的酵母细胞死亡;0.5 mM钙离子螯合剂EGTA或0.1 mM质膜Ca~(2+)通道特异性抑制剂LaCl_3亦可明显抑制Cr(Ⅵ)诱导的酵母细胞死亡;0.2 mM cPTIO或1 mM L-name亦可明显降低Cr(Ⅵ)引起的酵母细胞死亡。另外,加入cPTIO还能降低Cr(Ⅵ)处理组胞内Ca~(2+)水平,而EGTA不能降低Cr(Ⅵ)处理组胞内NO水平。结果表明Cr(Ⅵ)诱发酵母细胞死亡与处理组胞内ROS、Ca~(2+)和NO升高有关,NO可介导胞内Ca~(2+)浓度升高,高浓度Ca~(2+)可能通过诱导线粒体膜通透性转变孔道开放,导致线粒体膜电位下降,继而损伤线粒体功能导致细胞死亡。3.以本实验室前期构建的转金属硫蛋白(MT)酵母菌为材料,研究MT在Pb和Cr(Ⅵ)诱导酵母细胞死亡过程中的作用。结果显示,酵母经相同浓度Pb或Cr(Ⅵ)处理后,转MT酵母细胞死亡率显著低于宿主菌。并且,用相同浓度Pb或Cr(Ⅵ)处理酵母细胞后,发现转MT酵母菌和宿主菌胞内ROS,Ca~(2+)水平均有提高,但转MT酵母胞内ROS,Ca~(2+)水平显著低于宿主菌,说明MT可通过降低胞内ROS和Ca~(2+)水平来缓解Pb和Cr(Ⅵ)对酵母细胞的毒性效应。4.通过扫描电镜和傅里叶变换红外光谱对酵母菌的表面形态,元素组成和物质结构进行分析。结果表明,菌体光滑,表面积大,非常有利于对Cr(Ⅵ)的去除。通过分析结合Cr(Ⅵ)前后菌体的能谱图,可知酵母菌表面结合了大量Cr(Ⅵ)。傅里叶变换红外光谱研究显示,在菌体去除Cr(Ⅵ)的过程中,主要参与的官能团为羟基,氨基,磷酸基和酰胺基。考察了菌体投加量、时间、pH、温度及初始Cr(Ⅵ)浓度对转MT酵母菌去除Cr(Ⅵ)的影响。研究发现,菌体对Cr(Ⅵ)去除是一个快速过程,前15 min内去除量快速增加,随后增幅减缓,30 min后接近平衡;随溶液pH增大,菌体对Cr(Ⅵ)去除量逐渐降低,pH=1.0时,菌体对Cr(Ⅵ)去除量达到11.8 mg/g;在20℃~40℃内,菌体对Cr(Ⅵ)去除量随温度升高而增加;随着菌体投加量增大,菌体对Cr(Ⅵ)的去除量逐渐降低,当投加量为0.5 g/L时,转MT酵母菌对Cr(Ⅵ)去除量为8.01 mg/g;菌体投加量一定时,菌体对Cr(Ⅵ)去除量随溶液中初始Cr(Ⅵ)浓度升高而增大。等温模型研究显示,Langmuir和Freundlich都可以较为准确的描述宿主菌和转MT菌M1对Cr(Ⅵ)的去除行为。依据Langmuir等温式,工程菌对Cr(Ⅵ)的最大去除量为8.27 mg/g,优于宿主菌对Cr(Ⅵ)的最大去除量2.604 mg/g。通过对菌体去除Cr(Ⅵ)的过程进行动力学研究,发现Cr(Ⅵ)在转MT酵母菌上的去除符合准二级动力学方程,拟合相关系数R~2为0.9691。响应面分析及其等高线图表明:pH、温度及菌体投加量对Cr(Ⅵ)去除量线性效应均显著;pH与菌体投加量对Cr(Ⅵ)去除量的交互影响显著。pH与温度以及菌体投加量与温度对Cr(Ⅵ)去除量的交互影响不显著。通过求解二次回归方程的最大值得到菌体对Cr(Ⅵ)的最优去除条件为:pH 3.7,温度29.5℃,菌体投加量为2.02 g/L,此时,Cr(Ⅵ)去除量的预测值为6.49 mg/g。之后,根据响应面优化的Cr(Ⅵ)最佳去除条件,用工程菌对北方集团某电镀车间含Cr(Ⅵ)电镀废水进行处理,发现通过三批次连续处理后,废水中Cr(Ⅵ)含量低于国标规定污水排放标准0.5 mg/L,实现了对电镀废水的净化。5.利用转MT酵母菌吸附Pb离子,考察了菌体投加量、时间、pH、温度及初始Pb浓度对吸附效果的影响。研究发现,菌体对Pb吸附过程较快,20 min接近平衡;工程菌对Pb的吸附量随着pH上升,吸附量逐渐增加,pH=5时,吸附量达到最高,随后吸附量下降,逐渐趋于平缓。当初始Pb浓度从10 mg/L提高到90 mg/L时,M1菌对Pb吸附量从5.6 mg/g增加到48.3 mg/g;随着菌体投加量增加,菌体对Pb吸附量呈下降趋势;当温度从20℃升高到40℃,M1菌对Pb吸附量从30.6 mg/g增加到37.2 mg/g;等温模型研究显示,Langmuir和Freundlich两种模型都能很好描述转MT菌吸附Pb的行为。依据Langmuir等温式,工程菌对Pb最大吸附量为312.5 mg/g,优于宿主菌对Pb最大吸附量125 mg/g。通过对菌体吸附Pb过程进行动力学研究,发现Pb在转MT菌上的吸附符合准二级动力学,拟合相关系数R~2为0.9491。
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：X781.1;X172
【图文】：

概况,铬污染,铬渣

图 1.1 2005-2009 中国铅排放概况[17]Fig. 1.1 Pb emissions of China in 2005-2009及污染度最大的金属元素，具有高度的耐腐蚀性，主要被应用行业[18]。近年来，关于铬污染的事件不断发生。201水库，危及数千万人饮水安全。2012 年，央视报道许；环境中的铬污染主要来源于以下几个方面。一，铬每年排放的铬渣约 40 万吨左右，铬渣中含有大量铬酸体和土壤[19]；二是不锈钢、电镀、制革等行业排放的业废水中 Cr(Ⅵ)的排放量在 100 吨左右[21]；三是含铬在土壤中大量累积[22]。

中国工业,铬污染,铬渣,饮水安全

图 1.1 2005-2009 中国铅排放概况[17]Fig. 1.1 Pb emissions of China in 2005-2009染的金属元素，具有高度的耐腐蚀性，主要被应[18]。近年来，关于铬污染的事件不断发生。2，危及数千万人饮水安全。2012 年，央视报道境中的铬污染主要来源于以下几个方面。一，排放的铬渣约 40 万吨左右，铬渣中含有大量铬土壤[19]；二是不锈钢、电镀、制革等行业排放水中 Cr(Ⅵ)的排放量在 100 吨左右[21]；三是含壤中大量累积[22]。

死亡率,酵母细胞,硝酸铅,时间依赖性

图 2.1 铅对细胞生长的影响Fig.2.1 Effects of Pb on cell growth in yeast酵母细胞死亡.2 所示，在 3～24 h 内，酵母细胞死亡率与 Pb 浓越长，死亡率越高；经 2 mg/L 硝酸铅作用 3 h 后显差异，但在 24 h 后死亡率达 5.85%，明显高于h 后死亡率为 33.81%，显著高于对照组，表明 Pb和时间依赖性。

【参考文献】