吲哚好氧转化微生物群落结构及功能基因解析

发布时间：2020-07-27 18:15

【摘要】：吲哚广泛存在于自然界中,微生物、植物和动物代谢都能产生吲哚。研究表明吲哚是焦化废水和畜牧业废水中典型的氮杂环芳烃污染物,对人类健康和自然环境产生较大危害,吲哚的微生物转化是该类废水生物处理和资源化的关键。吲哚的生物转化研究始于上世纪20年代,迄今仍存在微生物群落信息缺乏、降解菌资源有限且降解机制不明晰等问题。本论文从微生物群落、纯菌特性及功能基因三个层面对吲哚好氧生物转化过程进行系统研究,主要内容及结论如下:利用Illumina高通量测序技术解析吲哚好氧转化的微生物群落信息,分别考察了实际焦化污泥和吲哚废水反应器污泥的微生物群落组成和结构。实际焦化废水处理厂活性污泥的微生物群落组成较为一致,主要菌属包括Thiobacillus、Comamonas、Gp4、Azoarcus、Thauera、Kineosporia、Ensifer和Rhodoplanes。进一步构建并运行两种吲哚模拟废水生物反应器,分别为市政污泥体系(A体系)和焦化污泥体系(B体系)。两个体系都能有效去除吲哚并且生成靛蓝类物质。微生物群落分析表明,当吲哚和葡萄糖共代谢时,Azoarcus和Thauera是污泥中的核心微生物,其在A和B体系中的相对丰度分别为37.94%和24.34%;当吲哚为唯一碳源时,Alcaligenes和Comamonas演变成核心菌属,其中Alcaligenes在B体系中的丰度高达49.41%,其他主要的菌属还包括Burkholderia、Pseudomonas 和 Cupriavidus 等。从吲哚驯化的微生物群落体系出发,利用微生物纯培养技术获取吲哚降解菌并考察其降解特性。通过吲哚驯化和反复平板涂布从反应器污泥等样品中筛选得到6株能以吲哚为唯一碳源生长的菌株,其中菌株Comomonas sp.IDO1、Comomonas sp.IDO2和Xenophilussp.IDO4 能在一周内去除 100 mg/L吲哚,菌株Burkholderia sp.IDO3、Cupriavidus sp.IDO和Cupriavidus sp.SHE 降解效率较高,能在 24 h 内降解 100 mg/L吲哚。选择菌株Cupriavidus sp.SHE进行深入研究,高效液相色谱和质谱分析表明菌株在吲哚无机盐培养基中生长时,中间产物为靛红、靛红酸和邻氨基苯甲酸。对菌株SHE进行全基因组和比较蛋白质组解析,菌株共有6581个蛋白编码序列,蛋白质组检测到1117个蛋白,其中118个蛋白显著上调,59个蛋白显著下调。上调变化的蛋白中有两个基因簇(基因簇Ⅰ和Ⅱ),序列比对分析表明基因簇Ⅰ可能参与吲哚氧化的过程,基因簇Ⅱ可能参与邻氨基苯甲酸的代谢过程。以吲哚降解菌株SHE的基因组和蛋白质组信息为基础,利用分子生物学技术阐明菌株SHE降解吲哚机制。RT-qPCR实验表明基因簇Ⅰ中she5651-she5654 4个基因在吲哚无机盐培养基中均显著上调表达;利用同源重组技术成功得到基因敲除菌SHE-A5652和SHE-A5653A5654,敲除菌的吲哚降解能力显著降低,且不能以吲哚为唯一碳源进行生长;对基因簇Ⅰ进行克隆实验,证实该基因簇能够催化吲哚转化,且she5652是负责吲哚氧化的功能基因,命名为indA。RT-qPCR实验表明基因簇Ⅱ中she1808-she1814 6个基因在吲哚无机盐培养基和邻氨基苯甲酸无机盐培养基中均显著上调表达;基因敲除菌SHE-△1814降解吲哚的能力和野生菌株SHE相似,但不能以吲哚和邻氨基苯甲酸为唯一碳源生长;对基因she1810进行异源表达和酶学分析,产物分析显示该蛋白能催化邻氨基苯甲酸生成邻氨基苯甲酸辅酶A。综上分析推测出菌株SHE降解吲哚的机制:吲哚首先在基因簇Ⅰ作用下被氧化,然后生成靛红和邻氨基苯甲酸,最后在基因簇Ⅱ作用下通过罕见的邻氨基苯甲酸辅酶A途径进一步降解。以吲哚降解过程中的功能蛋白为研究对象,利用生物信息学和基因重组技术探究吲哚加氧酶特性和应用。IndA与Pseudomonas菌株中传统的苯乙烯单加氧酶StyA相似性为30%左右,与Rhodococcus opacus菌株中新型的苯乙烯单加氧酶StyA1和StyA2B相似性为40-60%,在系统进化树中属于一个独立的分支,该加氧酶在Cupriavidus、Acientobacter和Burkholderia等菌属中广泛存在。IndA能在FAD和NADH存在下催化吲哚反应,在37"℃和pH 8.0的磷酸钾缓冲溶液中催化活性最高,对吲哚的Km和kcat值分别为0.36±0.10 mmol/L和1.53±0.16 min-1,此外IndA还能催化一系列吲哚衍生物反应生成色素类产物。将基因 indAB(she5652-she5651)导入到 Escherichia coli BL2l(DE3)中构建了重组大肠杆菌IND_AB,该菌株能催化色氨酸合成靛蓝,最适条件为:温度30℃,转速150r/min,接种时添加1.0mmol/LIPTG作诱导剂,在色氨酸1g/L、NaCl3.55g/L和酵母浸粉5.12 g/L的培养基中生长48 h,最终靛蓝产量为307mg/L,比未优化条件下靛蓝产量(70 mg/L)提高339%。
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：X703;X172
【图文】：

吲哚,化学结构

（１）吲哚的物化性质逡逑口引噪，化学式为Ｃ８Ｈ７Ｎ，ＣＡＳ登录号为１２０－７２－９，由苯环和Ｈ比略环并联形成的l#杂逡逑环芳香化合物，又称苯并吡咯，其结构如图１．１所示。吲哚的相对分子量为１１７．１５，熔逡逑点５２＿５°Ｃ，沸点２５４．７°Ｃ邋（１０１．３ｋＰａ），密度１．２２ｇ／ｃｍ３（１８°Ｃ）【ｌ】。在室温条件下吲哚为无逡逑色或白色晶体亮片状，溶于乙醇、乙醚、苯和丙酮等，在２０°Ｃ水中的溶解度为０．］９ｇ／〗００逡逑ｍＬ左右，但可溶于热水。吲哚是一种亚胺，浓度低时具有茉莉花香气，浓度高时具有逡逑粪臭味，该特点与其衍生物３－甲基吲哚类似，但３－甲基吲哚（粪臭素）浓度高时气味更逡逑加强烈持久。吲哚和３－甲基吲哚在动物肠道和排泄物中共同存在，是产生臭味的主要原逡逑因之一＿。逡逑Ｈ逡逑７逦１逡逑图１．１吲哚的化学结构逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｉｎｄｏｌｅ逡逑吲哚类物质是重要的精细化工中间体，广泛应用于医药、农药、印染等行业。例如逡逑吲哚及其衍生物具有一定的生物活性，包括抗炎性、抗菌活性、杀虫活性以及抗肿瘤活逡逑性等

吲哚,色氨酸酶,色氨酸合酶,色氨酸操纵子

ｅ逦ＤＩＭＢＯＡ逡逑图１．２植物合成吲哚的代谢途径逡逑ＴＳＡ是色氨酸合成酶ａ亚基，ＴＳＢ是色氨酸合成酶ｐ亚基，ＩＧＬ是磷酸－３－甘油磷酸裂解酶，ＢＸ卜７逡逑是合成Ｄ１ＭＢＯＡ的相关酶逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｉｎｄｏｌｅ邋ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｉｎ邋ｐｌａｎｔｓ逡逑ＴＳＡ邋ｉｓ邋ｔｈｅ邋ａ邋ｕｎｉｔ邋ｏｆ邋ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ，邋ＴＳＢ邋ｉｓ邋Ｐ邋ｕｎｉｔ邋ｏｆ邋ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ，邋ＩＧＬ邋ｉｓ邋ｉｎｄｏｌｅ－３－ｇｌｙｃｅｒｏｌ逡逑ｐｈｏｓｐｈａｔｅ邋ｌｙａｓｅ，邋ＢＸ１－７邋ａｒｅ邋ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｅｄ邋ｅｎｚｙｍｅｓ邋ｆｏｒ邋ＤＩＭＢＯＡ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ逡逑部分细菌具有合成吲哚的能力，关于其代谢机制和合成特性研宄比较深入。早在逡逑１８９７年，Ｔｈｅｏｂａｌｄ邋Ｓｍｉｔｈ就发现大肠杆菌能够产生吲哚吲哚在微生物中的代谢途径逡逑如图１．３所示。微生物体内的色氨酸合成酶基因簇似能够将分支酸依次转化为逡逑邻氨基苯甲酸、ＩＧＰ、吲哚和色氨酸，但是吲哚作为催化中间产物并不会从色氨酸合成逡逑酶中释放出来。不同于色氨酸合成酶，色氨酸酶可催化色氨酸生成吲哚、丙酮酸和氨。逡逑色氨酸酶操纵子含有三个基因

吲哚,细菌体,运输过程

，１１引噪会诱导大肠杆菌中多种转运基因的表达，包括ａｃｒＤ，ａｃｒ￡，出和但是这些转运基因在吲哚运输中的作用还未得到证明［４６ｅ等人一篇关于吲哚的综述中，提出目前关于吲哚的转运研宄一直何在细胞间运输对该领域的研究具有重要意义［２６］。在总结前人研ａｎｄｅｚ等人在２０１１年以￡．邋ｃｏ／／为研宄对象，利用体内和体外实验膜间的转运过程［４１１。在该研究中，对吲哚浓度的测定方法进行了胞内吲哚浓度的方法往往是首先收集和清洗细胞，然后破碎细胞量，但是由于吲哚能够迅速的进出细胞，这样会导致在清洗的过放出来影响实验结果。作者巧妙的利用了一个基于苯乙烯单加氧，苯乙烯单加氧酶在微生物体内表达，能够高效的将体内吲哚转蓝进行定量测定即可推算出吲哚的浓度。最后在体外实验中，测中转运过程，结果表明吲哚的转运不需要转运蛋白的参与，是一然作者不否认转运蛋白如Ｍｔｒ和ＡｃｒＥ可能在吲哚运输中扮演一被高估了。逡逑—Ｉｎｄｏｌｅ逡逑

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