转聚磷激酶基因生物构建及其聚磷特性研究

发布时间：2020-07-28 13:08

【摘要】：我国淡水水体富营养化问题十分突出,26个国控湖库中有61.6%的湖库处于V类和劣V类,湖泊富营养化的危害很大。因此,控制水体营养盐水平,提高水资源利用效率,具有重要的社会、经济价值。氮和磷是富营养化控制中最为重要的指标。富营养化水体的防治一方面要加强外源污染物输入的控制,减少氮、磷的向水体中的排放;另一方面是内源污染物的削减,减少内源营养物成为二次污染物的可能性。通过以上两方面的结合,最终降低富营养化压力,减少甚至避免蓝藻水华暴发等灾害性水污染事件的发生。外源性磷控制的主要途径是污水中磷的去除。在污水处理中主要应用的是生物除磷方法。生物除磷的机理是利用污水处理系统中存在的一类能够大量积累磷并转化为多聚磷酸盐的细菌(聚磷菌或硝化聚磷菌)将磷转化为细胞的一部分,形成活性污泥的形式排出,从而去除污水中的磷。提高生物除磷效率的一个关键途径是提高细菌中聚磷的含量,即提高活性污泥中磷的比例。当前的研究中发现多聚磷酸盐由聚磷激酶基因表达的聚磷激酶催化生成。目前有关聚磷转基因的应用仅限于实验室研究。本论文在假单胞菌体内转化广宿主、低拷贝重组质粒,用于高效表达聚磷激酶基因,获得了高效聚磷工程菌KTPPK。将KTPPK用于以火山石为生物滤料的序批式生物膜反应器,进行小试研究。研究发现,KTPPK在反应器中具有很好的除磷效果,系统运行200 hrs后,在好氧反应末期,含有KTPPK的反应器出水中P043--P浓度从实验初期的12 mg/L下降到低于2 mg/L。相比对照能够提高20%左右的除磷效率。内源性磷的削减有物理、化学和生物方法。生物方法如植物修复等具有经济、环境友好、能美化环境等诸多优点。传统植物修复从环境中寻找耐受性或超富集植物。例如利用宽叶香蒲构建人工生态湿地。但宽叶香蒲对重金属的富集主要集中在根部难以去除,且对氮磷的吸收能力有限。通过分子生物学手段能够克服以上问题。本课题针对富营养化水体的植物修复,选取宽叶香蒲和黄菖蒲作为关键植物。建立了一种宽叶香蒲从根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法。根培养为愈伤组织诱导提供了大量的材料,每粒萌发的种子能够诱导出12.7块愈伤组织,且在添加合适配比的生长素和分裂素之后,愈伤组织的再生能力也得以提高,生长速度加快,为植物的转基因工作和富营养化水体的植物修复提供了大量的材料,同时简化了苗再生的步骤。另外本研究建立了黄菖蒲悬浮培养体系,该体系能够促进愈伤组织快速、大量的形成,并能够用于苗的再生,为转基因提供大量受试材料的同时,能够快速大量的培养富营养化水体修复所需的植物材料。植物转化方法主要有农杆菌介导的转化方法和以基因枪等为代表的物理转化方法这两类方法。农杆菌介导的转化方法通常会受限于农杆菌和植物的种类、基因型以及两者间的相互作用关系。基因枪转化法能够不加区别的在植物细胞内引入外源DNA,但是通常效率很低。本研究将人工修饰的Tn5转座酶装备在金粉颗粒上,制备成轰击粒子。通过Tn5转座酶介导的转化方法获得了水稻、玉米和石斛兰植株。该方法一方面提高了转基因效率。最低装配20 ngDNA的金粉微粒转化水稻的效率也比传统基因枪法提高了两倍,而对玉米和石斛兰来说转化效率提高了近10倍(装配20 ngDNA);另一方面该转化方法降低了DNA多拷贝插入的几率,提高了遗传稳定性和正常表达的概率。对水稻来说,20个转化子在无选择压力下继代培养后能够得到8个单拷贝植株。对玉米和石斛兰来说,单拷贝比率分别为24%和33.3%(装配20ngDNA),远高于传统DNA包被的基因枪转化。基于以上方法,本研究成功将聚磷激酶基因转入水稻中,获得的转基因水稻能够提高1-5%的磷吸收效率,对构建高聚磷转基因植物提供了重要的参考价值。
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：X703
【图文】：

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本文编号：2772921