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水胺硫磷与乐果的降解途径、水解酶基因的克隆表达及基因工程菌的构建

发布时间:2020-07-28 20:15
【摘要】:有机磷农药是一类高效广谱的杀虫剂,在全世界范围内大量生产并广泛使用,为农业生产作出了卓越的贡献,但也带来了严重的环境污染问题,其污染环境的修复引起了广泛的关注。物理修复法和化学修复法存在成本高和产生二次污染等缺点,具有一定的使用局限性;微生物修复法由于微生物种类多、分布广、繁殖快、易变异、具有很强的适应能力、对各类合成杀虫剂能较快产生降解酶系、无二次污染等优点而被认为是最具潜力的修复方法。 本实验室研究微生物对有机磷农药的降解已有20多年的历史,分离得到许多高效有机磷农药降解菌株:Pseudomonas sp. DLL-1, Sphingomonas sp. Dsp-2, Ochrobacter sp. DDV-1和.Paracoccus sp. M-1等,但由于有机磷农药的多样性与复杂性,依然有一些有机磷农药还不能被降解。本研究的意义在于针对原先不能降解的有机磷农药如水胺硫磷、乐果等,分离、筛选高效降解菌株,并对菌株在各种环境条件下降解有机磷农药的特性进行研究,同时克隆有机磷农药的水解酶基因,构建降解能力更强和更广谱的有机磷农药降解工程菌,为有机磷农药环境污染的修复工作提供科学依据和良好的生物材料。 本文采用添加水胺硫磷富集培养的方法,从水胺硫磷污染的土壤中分离到一株水胺硫磷高效降解菌株scl-2,结合生理生化特性和系统发育分析,将菌株scl-2归类为节杆菌属(Arthrobacter sp.),该菌株不仅能高效降解水胺硫磷,同时能降解甲基异柳磷、哒嗪硫磷、丙溴磷等多种有机磷农药,为有机磷农药的生物降解提供了新的菌种资源。Arthrobacter sp. scl-2降解水胺硫磷的最适温度为35℃,最适pH为7.5,不受外加营养元素的影响,400 mg·kg-1的水胺硫磷对降解有很强的抑制作用,低浓度的水胺硫磷(5 mg·kg-1)对菌株的降解特性没有影响。Arthrobacter sp. scl-2在降解水胺硫磷时,液相检测到了3个代谢产物,结合质谱分析,分别鉴定为水杨酸异丙酯、水杨酸和龙胆酸,再通过测定龙胆酸开环酶系各酶的活力,推测出菌株代谢水胺硫磷的完整途径。从Arthrobacter sp. scl-2中克隆到有机磷农药水解酶基因oph,对oph编码的水解酶OPD进行了高效表达与纯化,对酶的特性进行了详细的研究,OPD酶降解有机磷农药的最适温度为35℃,最适pH为8,Ca2+、Li+等金属离子对酶的活性没有影响,该酶拥有很宽的底物范围,可降解目前国内市场上使用的多数有机磷农药。降解菌scl-2制成的菌制剂进行了南丰蜜桔水胺硫磷污染修复研究,水胺硫磷降解效率达到75%,表明降解菌株scl-2有着很强的应用前景。 采用富集培养的方法从乐果生产厂家的污水处理池的活性污泥中分离到一株乐果高效降解菌Paracoccus sp. lgjj-3,据我们所知,Paracoccus sp. lgjj-3是目前报道的降解乐果效率较高的菌株之一。Paracoccus sp. lgjj-3降解乐果的最适温度为30℃,最适pH为7.0,不受外加营养元素的影响,800 mg-kg-1的乐果对降解虽然有一定的抑制作用但依然能够被降解,低浓度的乐果(5 mg-kg-1)对菌株的降解特性没有影响。通过MS/MS和GC-MS联合检测,研究了Paracoccus sp. lgjj-3降解乐果的代谢途径,鉴定出7个代谢产物,首次推测了一条乐果在微生物作用下的降解途径。 为构建具有降解底物范围广和不带入外源抗性基因的生态安全型的基因工程菌株,本研究改造pUT mini-Tn5 Kml构建出染色体无标记随机整合pUTTns系列载体(pUTTnsKm, pUTTnsTet和pUTTnsCm)。该系列载体利用sacB基因作为反向筛选标记,利用同向重复序列发生重组去除外源抗生素抗性基因,载体具有改造的多克隆位点方便外源基因的插入,在载体抗性基因的两端有MluI酶切位点可针对不同菌株进行抗生素抗性基因置换。 利用模式菌株和野生型菌株进行基因整合试验验证了载体的功能,表明该载体能够多次将外源基因插入到革兰氏阴性细菌染色体上且不带入外源抗性基因。获得的工程菌株的生长特性与野生菌株没有差异,降解性能良好。本文利用该随机整合载体将本实验室克隆到的两个不具有同源性的有机磷农药水解酶基因mpd和oph先后插入到了乐果降解菌Paracoccus sp. L3的染色体上,构建了广谱且不带外源抗性基因的有机磷农药降解工程菌株Paracoccus sp. L3-mpd-oph,降解谱测定表明该工程菌株能够高效降解17种有机磷农药:水胺硫磷、甲基异柳磷、甲基对硫磷、敌敌畏、乐果、氧乐果等,该遗传稳定的工程菌株具有极强的应用前景。
【学位授予单位】:南京农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:X172
【图文】:

效果图,水胺硫磷,紫外扫描,菌株


图1一2HPLC检测菌株scl一2降解水胺硫磷Fig.l一2BiodegradationofisoearboPhosbystrainsel一2(testedbyHPLC)2.2菌株Sd一2的菌体形态及生理生化特征

水胺硫磷,菌株


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本文编号:2773392

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