恶臭假单胞菌S16分解代谢尼古丁分子机理研究

发布时间：2020-08-18 15:51

【摘要】：N-杂环化合物存在于工农业废弃物中,具有致癌、致畸、致突变等性质。尼古丁作为N-杂环化合物的一种,是高毒性的环境污染物。利用微生物去除尼古丁等环境污染物是最为可行的修复方法。课题组前期分离获得了一株高效降解尼古丁的菌株——恶臭假单胞菌S16(Pseudomonas putida S16),它采用吡咯途径代谢尼古丁。然而,假单胞菌属细菌代谢尼古丁的吡咯途径还很不完整:2,5-二羟基吡啶代谢的途径没有被揭示;转化3-琥珀酰吡啶(SP)的关键酶及其基因未知。另外,假单胞菌属细菌代谢尼古丁的调控机制还没有被报道。本论文在前期菌株S16全基因组测序和比较基因组分析的基础上,克隆获得了马来酸异构酶基因iso,在大肠杆菌中异源表达,验证了其编码产物Pp-Iso为菌株S16中催化尼古丁代谢吡咯途径最后一步(马来酸生成富马酸)的酶。在过去的几年中,课题组为了寻找尼古丁代谢吡咯途径中催化3-琥珀酰吡啶(SP)生成6-羟基-3-琥珀酰吡啶(HSP)的酶已作出了很多努力,包括基因组文库筛选、野生蛋白纯化等,但并未获得目的基因。本论文在菌株S16基因组和差异蛋白质组的基础上,通过序列分析定位了菌株S16中编码转化SP生成HSP酶的基因簇spmABC,其由3个重叠的基因spmA、spmB和spmC组成。构建了spmABC基因簇失活的突变株,在生长体系和休止细胞体系中验证了异型多聚体SpmABC的功能为SP羟化酶。然而在大肠杆菌中没有表达出有活性的SP羟化酶,分析文献发现,钼喋呤胞嘧啶二核苷酸(MCD)是SP羟化酶必不可少的辅因子,而且大肠杆菌不能合成MCD。因此,我们构建了spmABC基因簇回补的突变株,并在假单胞菌中成功表达了有活性的SP羟化酶。尼古丁代谢的生理生化机制已基本清楚,然而调控方面的研究开展的很少。本论文以菌株S16中nic2基因簇(包括基因hspB,orf5,iso,hpo,nfo和ami)为研究对象,研究了尼古丁代谢吡咯途径的调控机制。定位了假单胞菌属细菌中第一个参与尼古丁代谢的调控基因nicR2,构建了基因nicR2失活和回补的突变株,验证其功能为nic2操纵子的阻遏蛋白。凝胶阻滞和DNase I footprinting实验确定了NicR2的结合位点包含28 bp的回文序列,其效应物是HSP。进一步对菌株S16中调控蛋白NicR2与DNA的结合机制进行了研究,通过大分子相互作用实验确定了两个NicR2二聚体协同结合到DNA上,并通过凝胶阻滞实验确定了对NicR2的协同结合起到关键作用的DNA序列为(“CTATATGN6~8CATATAA”)。首次证实了回文序列的半位点(half-site)能够结合NicR2,并通过凝胶过滤和蛋白交联实验检测到了NicR2四聚体,暗示NicR2蛋白-蛋白之间存在相互作用。在此基础上,本论文提出了一种新的HTH型调控蛋白结合DNA的模型:调控蛋白以四聚体的形式特异地结合一个回文序列,每个二聚体结合回文序列的一个半位点。这种结合方式不同于其他用HTH结合DNA的蛋白,反而与某些β-片型调控蛋白结合DNA的方式类似。本研究丰富了原核生物转录调控的多样性。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：X172
【图文】：

4图 1.1 微生物分解代谢尼古丁的途径[7, 8, 27]途径 A 是节杆菌属微生物采用的吡啶途径；途径 B 是假单胞菌属微生物采用吡咯途径；途径 C 是推测的根癌农杆菌分解代谢尼古丁的吡啶-吡咯杂合途径。Fig 1.1 The pathways of nicotine catabolism in bacteria.

图 1.2 节杆菌中尼古丁代谢相关基因（簇）[7]ORF 下方的数字代表其编码蛋白的氨基酸数量Fig. 1.2 Arrangement of genes involved in nicotine catabolism on megaplasmid pAO1.2. 假单胞菌属细菌代谢尼古丁分子生物学研究假单胞菌属细菌代谢尼古丁吡咯途径的分子机制直到近年来才取得突破。其

只有噬尼古丁节杆菌 pAO1 中的两个转录调控蛋白（图1.3）。1. HdnoR节杆菌中代谢L-尼古丁的第二步反应是由6-羟基-L-尼古丁氧化酶6HLNO催化的，该酶只能催化 L-型对映体的降解，然而在该菌株中，L-型尼古丁也能够诱导 6hdno 基因的转录和表达。6hdno 基因位于大质粒 pAO1 上 ORF111 和 ORF113之间，这两个 ORF 都编码透性酶。RT-PCR 和引物延伸实验都表明 6hdno 基因单独构成一个操纵子，而且是诱导型表达的。6hdno 下游的 ORF114 编码转录调控

【共引文献】

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本文编号：2796421