美洲花蜱对杀虫剂的毒理学和生理学反应及长角血蜱雄性特异性抗菌肽的基因克隆和特性分析

发布时间：2020-08-27 20:25

【摘要】：蜱是一类以吸食哺乳类、鸟类和爬行类血液为生的体外寄生虫，传播的病原体比其它任何节肢类动物都要多，是一种危害严重的疾病媒介。全球每年由蜱类叮咬、传播疾病等引起的损失进二百亿美元，并且过去的二十年中蜱媒疾病的传播范围在逐渐扩大也越来越成为公众健康问题关注的焦点。人类在抵御蜱类寄生方面一直进行着不懈努力。本论文以美洲花蜱Amblyomma americanum和长角血蜱Haemaphysalis longicornis为研究对象，分别从毒理学、生理学、神经生理学和分子生物学方向对植物精油的杀虫活性、蜱中毒后的生理学反应和神经系统电生理活动的变化以及蜱类先天免疫机制进行了研究。论文成果对于蜱类防治药物的研究、更深入的了解杀虫剂导致害虫死亡的最终原因、探索蜱类与病原体相互作用关系和蜱类的适应机制具有重要意义。本论文主要的研究结果如下： 1、以饥饿阶段美洲花蜱若蜱为对象，利用毒理学方法检测了墨西哥牛至Lippia graveolens、多香果Pimenta dioica和荆芥Nepeta cataria L.三种植物粗提精油的杀虫活性。结果显示，三种植物精油对美洲花蜱都具有致死毒性，尤其在处理后24小时死亡率达到80%以上。半数致死剂量（LC50）以及处理后3小时和6小时死亡率和剂量之间的线性关系显示，同时间点墨西哥牛至的毒性显著高于多香果和荆芥，而后两者未表现出显著差异。为了为后面工作提供依据，对两种化学性杀虫剂—氯菊酯permethrin和阿米曲拉amitraz作用于美洲花蜱雌蜱的致死和半致死剂量也进行了测试，两者的致死和半致死剂量分别为0.010%、0.005%和16μg μl~(-1)、8μg μl~(-1)。 2、利用直流呼吸运动计量法对氯菊酯和阿米曲拉以及两者混合剂作用后美洲花蜱雌蜱的气体交换和水分平衡进行了检测。结果显示，所有对照组个体的呼吸都为不连续气体交换模式。氯菊酯处理的个体最初呼吸强烈之后转变为高频率的不连续模式，而阿米曲拉和混合剂处理后的呼吸呈明显的混乱状态。正常组和丙酮处理组的标准代谢率分别为0.461and0.452μl h~(-1)，且两组间无显著差异。三个杀虫剂处理组的标准代谢率显著高于对照组，氯菊酯处理组为1.054μl h~(-1)、阿米曲拉处理组为1.392μl h~(-1)、混合剂处理组为1.520μl h~(-1)。氯菊酯处理后1-2小时内虫体大量失水，且在不连续呼吸模式出现后每次呼吸都伴随水分丢失。与氯菊酯处理组相比，混合剂处理后个体同样大量失水，但这种失水现象不局限于处理后的1-2小时而是整个记录过程，然而未发现与呼吸同步的失水。对照组和阿米曲拉处理组未表现大量失水的现象。这些结果表明氯菊酯破坏了蜱体内水分保持机制，阿米曲拉使气门控制系统过度兴奋，而混合剂则引起两种药物的双重反应。 3、采用电生理学手段研究了氯菊酯、阿米曲拉及其混合剂处理后美洲花蜱附肢运动肌电信号活动的变化。实验中共记录到两种信号，分别命名为S1和S2。正常情况下蜱附肢中的神经信号具有较明显的模式，具有清晰的S1放电簇且记录到的两种信号差异明显。氯菊酯、阿米曲拉以及两者的混合剂处理后运动肌电信号出现了不同的变化。氯菊酯处理后S1放电簇频率降低但时长延长，阿米曲拉处理后S1放电簇逐渐紊乱，最终无明显规律，混合剂处理后出现了叠加性的反应，而处理1小时之后的反应也显示双重机制作用下虫体神经系统功能瘫痪。 4、从长角血蜱雄蜱附腺cDNA文库中分离得到编码抗菌肽的基因。基因全长349bp，编码79个氨基酸的防御素蛋白，基因被命名为HlMS-defensin。反转录PCR显示HlMS-defensin只在雄蜱中表达。采用real-time PCR技术分析了雄蜱不同组织和各吸血阶段HlMS-defensin的表达情况。结果表明HlMS-defensin主要在雄蜱附腺中表达并且随着吸血时间的延长表达量也不断升高。对成熟肽合成蛋白的抗菌活性分析显示HlMS-defensin对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌都具有活性。上述结果表明蜱类很可能通过抗菌肽来保护生殖系统不被病原微生物感染。
【学位授予单位】：河北师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：X174
【图文】：

多肽,唾液腺,分离鉴定,和中

也克隆鉴定到一条具明显防御素特点的多肽（Johns et al., 2001）。此后，又有许多蜱源防御素被陆续分离鉴定，这些多肽多在雌蜱唾液腺和中肠中表达（Cruzet al., 2010; Pichu et al., 2009; Saito et al., 2009）（图1）。

多肽,唾液腺,分离鉴定,和中

牛至,墨西哥,精油,死亡率

图 1.1 墨西哥牛至叶子粗提精油处理后美洲花蜱若蜱的死亡率。A: 1h，B：3h，C：6h，D：24h。浓度从左至右依次为 0（对照组）、0.04、0.07、0.15、0.29、0.58、1.17、2.33 和4.66 μg cm-2。Fig. 1.1 Mortality of nymphal Amblyomma americanum treated by essential oil of Lippiagraveolens leaves. A: 1h, B: 3h, C: 6h, D: 24h.率全部为 100%。表 1.1 列出了墨西哥牛至、多香果和荆芥三种植物粗提精油对美洲花蜱若蜱浓度-死亡率关系的概率分析结果。结果显示三种植物精油对美洲花蜱毒性程度不尽相同，其中同时间点相比墨西哥牛至的 LC50和 LC90值最低，并且置信区间与多香果和荆芥之间不存在重叠，说明墨西哥牛至的毒性明显高于后两者。相比而言，多香果和荆芥的 LC50和 LC90值要高很多，尤其处理后 1、3、6 小时的 LC50和 LC90比墨西哥牛至高几十倍甚至几百倍，并且两者的置信区间也存在重叠现象，说明这两种药物毒性相近。斜率值的大小反映了药物浓度变化

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