镉致大鼠肝细胞毒性机理研究

发布时间：2020-09-04 14:39

　　 镉是许多工业广泛使用的高毒重金属环境污染物,镉对人和其他哺乳动物的肝、肾、肺、胰腺、睾丸、胎盘和骨等许多器官和组织都有毒性。镉所致机体损伤的机制十分复杂且尚不明确,体内外实验研究证明镉可引起细胞氧化应激或凋亡/死亡,且凋亡与线粒体、细胞内钙离子动态平衡、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活等有关。对啮齿动物研究证明,镉最初主要累积在肝脏,所以暴露毒性剂量的镉首先引起肝脏受损。本论文以大鼠肝细胞为模型,采用细胞生物学和分子生物学的方法研究镉致体外培养大鼠肝细胞的毒性作用及机理。 1.镉对大鼠肝细胞毒性损伤的研究 采用两步灌流法获得大鼠肝细胞,经过24h培养,换以含2.5、5、10μmol/L醋酸镉的无血清培养基培养12h和24h,测定镉对细胞存活率、细胞培养上清液中LDH、ALT和AST的活性,以及镉对细胞形态、超微结构的影响。 结果表明,随着镉浓度的增大,肝细胞的存活率逐渐降低,12h和24h时各剂量染镉组细胞存活率均极显著低于对照组(P0.01)；随着镉剂量的增加和作用时间的延长,细胞急剧变形,坏死细胞增多,线粒体肿胀变形,线粒体嵴模糊,内容物皱缩空泡化或最终崩解。LDH、AST和ALT释放量随剂量增加而增加,部分剂量组LDH、AST和ALT活性与对照组相比差异显著或极显著(P0.05或P0.01)。 2.镉对大鼠肝细胞凋亡及氧化损伤的研究 醋酸镉处理肝细胞,测定镉对细胞凋亡率、氧化应激指标、活性氧(ROS)水平及线粒体膜电位(△Ψm)的变化。 结果表明,12h时细胞内GSH含量随镉剂量增高而降低,部分剂量组极显著(P0.01)低于对照组,24h时随剂量增高而升高,5和10μmol/L剂量组显著或极显著(P0.01)高于对照组,GSH-PX的活性变化与之相反；随着镉剂量的增大和作用时间延长,SOD和CAT活性、MDA含量均升高,部分剂量与对照组相比差异显著或极显著(P0.05或P0.01)；而GST和GR活性降低,但与对照组无明显差异(P0.05)；细胞凋亡率升高,细胞内ROS水平增加和△Ψm降低,部分剂量组与对照组差异显著或极显著(P0.05或P0.01)；表明镉可致肝细胞产生氧化应激,且通过线粒体途径引起细胞凋亡。 3.N-乙酰半胱氨酸对镉致肝细胞损伤的影响 对肝细胞染毒的同时添加NAC,通过测定肝细胞的存活率、细胞形态和凋亡、△甲m和ROS的变化,观察NAC对镉致大鼠肝细胞损伤的保护作用。 结果表明,NAC可显著或极显著提高镉处理细胞存活率(P0.05或P0.01),呈剂量-效应关系,NAC可使镉处理组皱缩和坏死细胞、凋亡细胞明显减少,显著或极显著降低镉处理细胞ROS生成和阻止△Ψm的降低(P0.05或P0.01)。表明NAC可有效保护镉致大鼠肝细胞的毒性损伤。 4.镉致大鼠肝细胞凋亡的非caspase途径 用醋酸镉处理肝细胞,观察caspase-3含量变化以及caspases广谱抑制剂Z-VAD-fink对镉致细胞存活率、形态和凋亡变化的影响。 结果表明,镉暴露的不同时间,肝细胞caspase-3活性无明显变化,与对照组差异不显著(P0.05); Z-VAD-fmk对镉所致的细胞存活率、细胞形态和细胞凋亡无显著影响。表明caspase途径未参与镉致大鼠肝细胞的凋亡过程。 5.钙离子超载在镉致大鼠肝细胞凋亡中的作用 通过不同浓度醋酸镉处理肝细胞,不同时间点测定细胞内钙离子浓度,以及钙离子抑制剂Bapta-AM对镉致细胞内钙离子浓度、细胞存活率、细胞形态、细胞凋亡、细胞内ROS和△Ψm变化的影响。 结果表明,镉暴露1.5h时细胞内钙离子水平极显著升高(P0.01),但随着时间的延长,细胞内钙离子水平迅速下降,并接近对照组水平。而Bapta-AM可以显著降低镉引起的钙离子水平升高,并显著提高镉处理细胞的存活率(P0.05)。另外Bapta-AM可使镉处理细胞形态趋于完整、并使变形细胞和凋亡细胞减少,显著或极显著减少ROS产生和抑制△Ψm降低(P0.05或P0.01)。说明镉可致肝细胞内钙离子水平升高,钙离子抑制剂Bapta-AM能有效降低细胞内钙离子水平及细胞损伤,提示钙离子超载在镉致肝细胞凋亡中发挥重要作用。 6.镉致大鼠肝细胞凋亡的MAPK途径 在10μmol/L醋酸镉处理肝细胞的同时,用p38抑制剂SB202190、JNK抑制剂SP600125、ERK抑制剂U0126单独或联合作用于肝细胞,测定细胞存活率、细胞形态、细胞凋亡率、△甲m和磷酸化p38蛋白表达的变化。 结果表明,SB202190可以显著或极显著提高镉处理组细胞的存活率,减少变形细胞和凋亡细胞数量(P0.05或P0.01),但SP600125和U0126作用相反。镉可极显著提高肝细胞磷酸化p38的表达量(P0.01),而SB202190能极显著降低其表达(P0.01)；SB202190还可极显著升高镉引起的△甲m降低(P0.01)。说明镉暴露使肝细胞产生的ROS引起p38 MAPK途径激活,并通过损伤线粒体引起细胞凋亡。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2010
【中图分类】：X174
【部分图文】：

刚分离的大鼠肝细胞Fig.l-1Freshisolatedrat图1-2台盼兰染色的肝细胞图1一培养24h的大鼠肝细胞Fig.l

HePatocytestreatedwith0-10娜 oljLCdfor12hor24h2.2锡对细胞内SOD和CAT活性、MDA含量的影响如表2一2和图2一5砚一7所示。12h时，随着福浓度的增大，SOD和CAT活性、MDA含量均升高，福的浓度为5娜。讥和10脚。讥时，soD的活性与对照组相比差异极显著(p<0.01);福的浓度为10林mo比时，CAT的活性和MDA的含量与对照组相比差异极显著或显著(尸<0.01或尸<0.05)。24h时，随着福浓度的增大，SOD和CAT活性均升高，锅的浓度为10林mol几时，SOD活性和MDA含量与对照组相比差异分别极显著或显著(P<0.01或尸<0.05);锅的浓度高于5娜。讥时

02.55以(卿。比)图2一4福对肝细胞GR活性的影响o一10卿ol/L锡作用肝细胞12h或24hFig.2一 4EffectofCdontheGRactivityinhePatoeytes HePatocytestreatedwith0-10娜 oljLCdfor12hor24h2.2锡对细胞内SOD和CAT活性、MDA含量的影响如表2一2和图2一5砚一7所示。12h时，随着福浓度的增大，SOD和CAT活性、MDA含量均升高，福的浓度为5娜。讥和10脚。讥时，soD的活性与对照组相比差异极显著(p<0.01);福的浓度为10林mo比时，CAT的活性和MDA的含量与对照组相比差异极显著或显著(尸<0.01或尸<0.05)。24h时，随着福浓度的增大，SOD和CAT活性均升高，锅的浓度为10林mol几时，SOD活性和MDA含量与对照组相比差异分别极显著或显著(P<0.01或尸<0.05);锅的浓度高于5娜。讥时

【引证文献】

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本文编号：2812232